分享一篇發表在 PNAS 上的文章，標題為“Metabolic control of glycosylation forms for establishing glycan-dependent protein interaction networks”，通訊作者是來自華盛頓大學的 Benjamin A. Garcia 教授和復旦大學粵港澳大灣區精準醫學研究院的謝一軒研究員，Benjamin A. Garcia 教授主要從事蛋白和核酸修飾與表觀遺傳等相關質譜的測定及工具開發，謝一軒課題組聚焦于 RNA 糖基化及糖組學，蛋白質組學，表觀組學的測定與分析。
迄今為止，研究人員在人類蛋白質組方面已揭示了超過 90% 的人類蛋白質組，下一個挑戰在于對每種已鑒定蛋白質及其蛋白質形式的功能進行表征。鑒于蛋白質在生物體內并非孤立運作，研究蛋白質功能的一個關鍵方面是通過其蛋白質-蛋白質相互作用（PPIs）。質譜（MS）一直是高通量鑒定 PPIs 方法中的關鍵技術。常用于結合 MS 研究 PPIs 的方法包括親和純化、鄰近標記和交聯等每種方法在檢測 PPIs 方面都有其最佳應用場景。盡管所有基于 MS 的 PPIs 及其變化的映射方法都有其優勢和局限性，但幾乎所有方法的一個重大挑戰是解析由蛋白質修飾引起的改變。大多數蛋白質會經歷共翻譯或翻譯后修飾產生不同的蛋白質形式，并強烈影響母體蛋白質的功能或活性。這些蛋白質修飾由于其固有的復雜性引入了一個新的維度，而在構建 PPIs 網絡時，不可避免地會忽略修飾的影響。
這種復雜性的一個關鍵例子是糖基化，糖基化蛋白質是被稱為糖萼的高度交互性細胞外層膜的重要組成部分。糖基化的變化會顯著影響糖萼的生物學功能。由于糖基化的復雜性和多樣性，研究涉及膜蛋白的 PPIs 面臨很大挑戰。因此本文作者開發了一種稱為聚糖依賴性親和純化結合質譜（GAP-MS）的方法，該方法專門用于表征不同糖基化條件下糖蛋白 PPIs 的變化，提供了關于特定聚糖類型如何塑造相互作用模式的獨特見解。
圖 1. GAP-MS 原理圖
GAP-MS 技術是對培養細胞中糖鏈的代謝調控（使用稱為糖鏈修飾劑的小分子）與親和純化后進行質譜分析的流程相結合（圖 1）。作者選用了巖藻糖（Fucose）、3-氟代唾液酸（3-F-Sia）和 α-甘露糖苷酶I抑制劑（Kif）等糖鏈修飾劑對培養細胞中的糖鏈進行代謝調控（圖 1B），在巖藻糖基化缺陷的人結直腸癌細胞系 HCT116 發現了唾液酸化（S）、未修飾（Undec 或 Und）、巖藻糖基化（F）、唾液酸巖藻糖基化（FS）和高甘露糖基化（HM）五種主要的糖鏈表型（圖 1C），每種表型均以特定糖鏈形式的顯著增加為特征。因此作者進一步推測這種控制糖鏈表型的體系可以與親和純化-質譜聯用（AP-MS）以鑒定由于糖鏈形式改變而導致的 PPIs 的變化，理論上適用于任何可以在 HCT116 細胞中外源表達的目標糖蛋白（圖 1A）。作者進一步選擇了四種誘餌糖蛋白，包括免疫球蛋白 BSG、表皮生長因子受體（EGFR）、CD44 和氨基酸轉運蛋白重鏈 SLC3A2 四種（圖 1E），通過 GAP-MS 發現 156 種高置信度相互作用，其中近 45% 是新發現的，展示了 GAP-MS 在監測糖蛋白相互作用方面的靈敏度，并且大多數相互作用（156 種中的 131 種）參與構建了糖鏈依賴性蛋白質相互作用組（GDPI）。
圖 2. 糖組學和糖蛋白質組學監測了用不同修飾劑處理 HCT116 細胞后的糖型。
為驗證糖鏈修飾劑是否能夠改變糖型，作者對五種條件下培養的 N-糖鏈進行糖組分析。通過對 PNGase F 釋放所提取到細胞膜 N-糖鏈，并對 N-糖鏈進行圖譜分析（圖 2A）。作者發現天然 HCT116 細胞完全缺乏巖藻糖基化，且以唾液酸化糖鏈（S 型）為主。同時，巖藻糖處理后的細胞產生了唾液酸巖藻糖基化糖鏈（SF型），而 3-F-Sia 和巖藻糖聯合處理則使糖鏈轉化為巖藻糖基化糖鏈（F 型），僅用 3-F-Sia 處理可產生超過 55% 未修飾糖鏈（無唾液酸或巖藻糖，Undec 型），高甘露糖基化糖鏈的相對豐度存在變化，這歸因于糖鏈離子化效率的差異。最后，甘露糖苷酶抑制劑處理后的細胞中超過 95% 為高甘露糖基化糖鏈（HM 型），突出了 HCT116 細胞在生理條件下的獨特糖鏈特征（圖 2B）。作者進一步以 CD44、BSG、EGFR 和 SLC3A2 糖蛋白為誘餌，啟動了對糖鏈依賴性 PPIs 的鑒定工作。為了確認過表達的誘餌蛋白上的糖鏈能夠被糖鏈修飾劑充分調控，作者闡明了這四種蛋白在穩定表達誘餌蛋白的細胞系中的位點特異性糖肽信息（圖 2C），在五種條件下主要產生了具有不同 N-糖型的誘餌糖蛋白并于上述結果一致，證明了 GAP-MS 的穩健性。
圖 3. GAP-MS 中糖鏈依賴性蛋白質相互作用組（GDPI）
隨后作者采用數據獨立采集（DIA）蛋白組學工作流程，鑒定并定量與誘餌蛋白共純化的蛋白，從 4 種誘餌蛋白的 GAP-MS 分析中鑒定出 85 種相互作用蛋白和 156 種相互作用關系（圖 3A），并在其中發現 66 種相互作用在 STRING 或 BioGRID 數據庫中未被記錄，因此被認為是通過 GAP-MS 平臺新鑒定出的。作者統計了來自四種誘餌蛋白的富集糖蛋白數量，發現有 26 種蛋白是糖基化的，涵蓋了 53 種相互作用。并且不同捕獲蛋白的相互作用邊中發現 85 種蛋白中有 47 種（>55%）具有不止一種相互作用以及 26 種糖蛋白中近 60%（15 種）被不止一種誘餌蛋白富集，展示了細胞膜糖萼的整合性和復雜性。作者進一步對網絡中的蛋白進行了基因本體（GO）富集分析，對于生物過程，分析顯示與運輸、定位、細胞黏附及其他細胞過程相關的類別顯著過表達。分子功能分析確定了高度富集的類別，如轉運活性、催化活性和各種結合功能——這些特征與細胞表面環境的動態和互動特性緊密吻合（圖 3B，3C）。理論上，在每種糖鏈表型下，總網絡中的 156 種相互作用可分為三類：a) 被糖鏈主要形式增強的相互作用；b) 在該類型中受阻的相互作用；c) 未受強烈影響的相互作用。基于平均 TopS 分數，作者為所有糖鏈表型生成了 5 個增強子網絡（包含 TopS 分數 > 20 的相互作用）和 5 個抑制子網絡（包含 TopS 分數 < -20 的相互作用）（圖 3D-3M）。
圖 4. GAP-MS 數據顯示不同糖鏈表型對相互作用對的影響各異
為揭示當前數據集中可能存在的共現聚糖依賴性模式，作者對所有 5 種條件下 156 種相互作用的平均 TopS 分數進行了 k-means 聚類分析。如圖 4A 所示，根據不同聚糖表型對相互作用的影響方式，總網絡中的所有相互作用被一致劃分為 6 個簇。每個簇中的相互作用示例分別展示在圖 4B 以及每個簇的總結則在圖 4C 的表格中列出。其中，簇 1、簇 2 和簇 3 分別包含在特定糖鏈表型下（簇 1 為高甘露糖型，簇 2 為巖藻糖型，簇 3 為未修飾型）被顯著增強的相互作用，而在其他類型中則要么受到適度抑制，要么未受到顯著影響。在簇 4 中，相互作用通常不會受到任何表型的顯著影響；總體模式表明，它們大多在高甘露糖型和未修飾型中受到抑制，而在唾液酸型和唾液酸巖藻糖型中則大多被增強。簇 5 包含兩個不同的模塊：相互作用在高甘露糖型、未修飾型和巖藻糖型中受到抑制，但在存在唾液酸的情況下（即唾液酸型和唾液酸巖藻糖型）則顯著增強。簇 6 僅有 5 種相互作用，它們在高甘露糖型中受到顯著抑制，但在未修飾型中則明顯增強。細胞膜上的糖蛋白具有高度的互作性，這導致某些被捕獲蛋白會被多種誘餌蛋白捕獲。有趣的是，同一種被捕獲蛋白與不同誘餌蛋白之間的相互作用并不總是落入同一個聚類中。糖蛋白對糖鏈變化的響應方式不一定相同。在每種糖鏈表型下，不同誘餌蛋白的增強或抑制子網絡中的相互作用對分布各不相同（圖 4D）。
總而言之，作者開發了一種名為聚糖依賴性親和純化結合質譜分析（GAP-MS）的方法，專門用于表征在不同糖基化條件下糖蛋白 PPIs 的變化。GAP-MS 整合了利用小分子糖鏈修飾劑對培養細胞中糖型的代謝調控，并結合親和純化及質譜分析（AP-MS）。GAP-MS 被應用于表征并比較四種誘餌糖蛋白（BSG、CD44、EGFR 和 SLC3A2）在五種不同糖基化狀態下相互作用網絡，該分析鑒定了包含 156 種相互作用的網絡，其中 131 種被確定為糖鏈依賴性相互作用。值得注意的是，與常用的糖基化位點突變方法結合 AP-MS 相比，BSG 的 GAP-MS 分析提供了有關糖基化影響相互作用的不同信息，強調了 GAP-MS 的獨特優勢，較現有方法提供了獨特見解。此外，本文為這四種糖蛋白生成的糖鏈依賴相互作用網絡，為指導未來針對本研究中討論的糖蛋白的功能調查和治療開發提供了寶貴資源。
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文章作者：CW
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