介紹一篇發表在Analytical Chemistry上的文章“A Detergent-Free Grinding Sample Preparation Method Dramatically Enhances PELSA for Mapping Integral Membrane Proteins–Ligand Interaction”，通訊作者是來自大連化物所的葉明亮教授，葉老師的主要研究方向是蛋白質組學及翻譯后修飾鑒定。

PELSA（peptide-centric local stability assay, 肽段中心局部穩定性分析）技術在鑒定蛋白質-配體方面提供了有力的技術支持，但該方法與其他基于蛋白質穩定性的技術都通常使用不含洗滌劑和變性劑的緩沖液來提取蛋白質，以保持蛋白質的天然構象，這使得這類方法對整合膜蛋白（IMPs）的鑒定變得困難。因此，本文聚焦于解決傳統去垢劑提取膜蛋白易破壞其天然構象、干擾配體結合分析的技術瓶頸，開發了一種無去垢劑的機械研磨樣品制備方法（Detergent-Free Grinding sample preparation method, DFG），并與PELSA聯用，構建新型蛋白質組學平臺DFG-PELSA，用于高效、高靈敏度地鑒定整體膜蛋白與配體的相互作用及結合區域，推動基于結構的藥物發現與毒性機制研究。

該技術核心流程如下：DFG樣品制備時將細胞與不銹鋼研磨珠置于–40 °C預冷系統，以5 m/s、30 s×2循環進行機械研磨，離心獲得含膜碎片、囊泡及蛋白-脂質復合物的PBS懸液，無需去垢劑。為鑒定該方法的提升效果，文章中主要將其與傳統的液氮反復凍融制樣發進行比較。實驗結果中，DFG法從HeLa細胞中鑒定1090種跨膜蛋白，是凍融法的2.5倍，與0.5% DDM去垢劑法相當，且磷脂含量提高2.4倍，鑒定到的蛋白顯著富集于膜系統（如線粒體膜、內質網膜等），證明機械研磨可高效釋放膜組分并保持天然構象。

隨后，作者在膜蛋白提取優化的基礎上，將研磨法與PELSA結合，構建DFG-PELSA平臺，考察DFG-PELSA是否能提升對跨膜蛋白靶點的識別效率。選用ATP類似物AMP-PNP，比較研磨與凍融法在識別ATP結合蛋白方面的差異。結果中，作者新發現多個跨膜ATP結合蛋白并精確定位AMP-PNP結合區域。且值得注意的是，該方法也保留了對可溶性蛋白靶點的識別能力。

作者將該方法推廣到多個應用，一是解析EGFR-TKI的on/off-target機制，二是檢測跨膜區配體結合的遠程效應（即DFG-PELSA是否能檢測配體結合于跨膜區所引起的構象變化），證明了該技術適用于研究復雜膜蛋白的變構機制。

總的來說，DFG-PELSA突破了傳統膜蛋白配體篩選的技術瓶頸，為藥物靶點發現、毒性機制闡明及難成藥膜蛋白功能研究提供了強有力的原生態蛋白質組學工具。

本文作者：FTY

責任編輯：MB

DOI：10.1021/acs.analchem.5c03099

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c03099