環(huán)氧化合物（結(jié)構(gòu)見圖1）通常作為原料藥或原料藥中間體合成中使用非常廣泛的起始物料，例如抗凝藥物利伐沙班中，利用 (S)-2,3-環(huán)氧丙醇來合成其關(guān)鍵中間體，S-環(huán)氧氯丙烷則是利奈唑胺原料藥合成中用到的一個(gè)關(guān)鍵起始物料。由于環(huán)氧化物三元環(huán)的剛性結(jié)構(gòu)，環(huán)張力較大，具有很高的反應(yīng)活性，在藥物合成過程中易與胺基、有機(jī)金屬試劑、鹵代化合物、芳香化合物、氰化物等親核試劑發(fā)生反應(yīng)而開環(huán)，環(huán)氧化物的兩個(gè)親電性碳原子能夠與DNA結(jié)構(gòu)中的親核中心反應(yīng)，形成烷基化產(chǎn)物，導(dǎo)致DNA突變而危害人類健康。

圖1.環(huán)氧化合物結(jié)構(gòu)圖

環(huán)氧化物具有警示結(jié)構(gòu)，是已知的潛在基因毒性雜質(zhì)，其結(jié)構(gòu)種類繁多，是基因毒性雜質(zhì)中較為常見的一類。藥品生產(chǎn)過程中是否有環(huán)氧化合物的殘留已成為基因毒性雜質(zhì)是現(xiàn)階段藥物研究過程中重要討論和控制的內(nèi)容，也已成為國內(nèi)外藥品注冊審評不可缺少的項(xiàng)目。由于環(huán)氧化合物在高溫下極易容易分解，給分析方法的建立帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

根據(jù)參考各國藥典及文獻(xiàn)，總結(jié)了部分含有環(huán)氧化合物類基因毒雜質(zhì)藥物的種類，詳見表1。

表1. 含有環(huán)氧化合物類基因毒雜質(zhì)藥物列表

直接檢測法：

對于具有一定揮發(fā)性的環(huán)氧化合物，如環(huán)氧乙烷，因其具有很強(qiáng)的揮發(fā)性，所以氣相色譜法是此類基因毒雜質(zhì)的主要檢測分析手段。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用GC-FID法直接測定阿莫卡蘭中的環(huán)氧乙烷的殘留量，其LOD為0.09 μg/g，可達(dá)到較高的精密度和靈敏度。近年來，對環(huán)氧氯丙烷（ECH）雜質(zhì)檢測方法報(bào)道也比較多，常用氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法直接進(jìn)行檢測。

對于非揮發(fā)性環(huán)氧化物則采用液相色譜法進(jìn)行檢測。文獻(xiàn)顯示，采用HPLC-UV法分別檢測地塞米松中的一對差向異構(gòu)體16α-甲基環(huán)氧化物和16β-甲基環(huán)氧化物，兩者的分離度大于3，LOQ均為30 ng/mL。

衍生化法：

環(huán)氧化合物化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，且有些環(huán)氧化物是中性分子，不容易在ESI離子源中質(zhì)子化和去質(zhì)子化，因此無法通過MS檢測器來直接檢測。當(dāng)樣品不能直接進(jìn)樣分析時(shí)，為了滿足分析方法的要求，通常會(huì)選擇柱前衍生的方法，將其轉(zhuǎn)化為容易質(zhì)子化的化合物或具有強(qiáng)紫外吸收的化合物，從而提高環(huán)氧化合物的檢測靈敏度。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用二甲胺作為衍生化試劑，結(jié)合ESI-MS檢測方法對原料藥中的環(huán)氧化物進(jìn)行了殘留量的測定，LOD能夠達(dá)到1ng /mL。也有不少文獻(xiàn)采用3,5-二氟芐胺、N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺、亞硫酸鈉等作為衍生化試劑測定水中或者其他基質(zhì)中的環(huán)氧化合物，通過借鑒這些方法并進(jìn)行方法優(yōu)化，則也可以應(yīng)用于藥物中環(huán)氧化物基因毒雜質(zhì)的測定。

其他方法：

衍生化法并不適用于所有環(huán)氧化合物，特別是含有多個(gè)親電基團(tuán)的環(huán)氧化合物，如：(2R)-2-[(5-溴-2,3-二氟苯氧基)甲基]環(huán)氧乙烷、(R)-對甲苯磺酸縮水甘油酯等，衍生化反應(yīng)可能會(huì)生成多個(gè)產(chǎn)物，給檢測帶來巨大困難與挑戰(zhàn)，為了能夠有效檢出，這類化合物可以采用配位離子噴霧質(zhì)譜（CIS-MS）法直接法進(jìn)行測定，在CIS-MS中，環(huán)氧化合物中性分子在溶液中或者氣相狀態(tài)下容易轉(zhuǎn)變?yōu)閹д娀蛘邘ж?fù)電的化合物，能夠有效提高其檢測靈敏度。

鹽酸普洛萘爾：

鹽酸普洛萘爾（Propranolol，化合物1，圖2），是β受體阻斷類藥物中的代表藥物，在臨床上廣泛應(yīng)用于心律失常、心絞痛等疾病。在鹽酸普洛萘爾的合成工藝（圖2）中，一般以α-萘酚與環(huán)氧氯丙烷（ECH）作為起始原料，得到中間體4，之后中間體4在異丙胺中發(fā)生開環(huán)反應(yīng)得到中間體5，最后在加熱回流環(huán)境中進(jìn)行鹽酸化處理反應(yīng)制得鹽酸普洛萘爾成品。鹽酸普洛萘爾的合成工藝中使用到的環(huán)氧氯丙烷（化合物3，圖2）具有警示結(jié)構(gòu)，為已知的基因毒性雜質(zhì)，因此必須對其進(jìn)行嚴(yán)格控制。

圖2. 鹽酸普洛萘爾的合成工藝

因此，采用GC-FID的方法測定環(huán)氧氯丙烷。根據(jù)ICH指南要求，對該方法進(jìn)行了檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、線性、精密度、準(zhǔn)確性等相關(guān)驗(yàn)證，環(huán)氧氯丙烷在2 ppm~11.25 ppm的范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9985，環(huán)氧氯丙烷的LOD和LOQ分別能夠達(dá)到0.5 ppm及2 ppm，平均回收率為97.2%，該方法靈敏度非常高、操作簡單且無機(jī)制干擾，適合在痕量水平下對鹽酸普洛萘爾中基因毒雜質(zhì)環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行控制。

卡維地洛:

卡維地洛（Carvedilol，化合物6，圖3）是由德國Boehringer Mannheim公司開發(fā)的第三代β受體阻滯劑，該藥于1991年首次在美國上市。卡地維洛的合成是以4-羥基-9H-咔唑（化合物7，圖3）為原料，在強(qiáng)堿催化下，反應(yīng)形成中間體8，然后中間體8與另一個(gè)中間體2-（2-甲氧基苯氧基）乙胺（化合物9，圖3）反應(yīng)得到卡維地洛成品。事實(shí)上，該合成工藝的中間體4-(2,3-環(huán)氧丙氧基)-9H-咔唑（化合物8，圖3）含有環(huán)氧化合物的警示結(jié)構(gòu)，具有潛在的遺傳毒性和致癌性，因此，依據(jù)EMA和FDA相應(yīng)的指導(dǎo)原則，有必要對卡維地洛中的4-(2,3-環(huán)氧丙氧基)-9H-咔唑的殘留進(jìn)行定量分析。根據(jù)ICH發(fā)布基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 μg/d計(jì)算，卡維地洛最大日劑用量為100 mg/d，則對應(yīng)的基因毒性雜質(zhì)4-(2,3-環(huán)氧丙氧基)-9H-咔唑的TTC水平為15ppm。

圖3. 卡維地洛合成工藝

因此，采用LC-MS直接檢測的方法對4-(2,3-環(huán)氧丙氧基)-9H-咔唑進(jìn)行定量，在該方法下LOQ 為2.68 μg/g，LOD 為 0.825 μg/g，在0.2~22.5 μg/g的濃度范圍內(nèi)均成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，回收率為96.7-101.5%。該方法快速、簡單、準(zhǔn)確且經(jīng)全面驗(yàn)證后符合檢測的需求。

環(huán)氧化合物作為潛在的基因毒性雜質(zhì)，通常作為起始物料或中間體存在于藥物合成過程中，這些物料通常會(huì)作為雜質(zhì)存在于終產(chǎn)品中，可能具有遺傳毒性和致癌性而危害病人的健康。因此，藥品中如果含有上述種類的基因毒性雜質(zhì)，就需要對其進(jìn)行嚴(yán)格的控制。由于環(huán)氧化合物種類繁多，且化學(xué)性質(zhì)各異，因此需從靈敏度、選擇性、待測物穩(wěn)定性、基質(zhì)復(fù)雜性等進(jìn)行全方面分析，選擇合適的分析檢測手段。

值得注意的是，有時(shí)采用基因毒性物質(zhì)作為起始物料或反應(yīng)試劑是不可避免的，除此之外，還會(huì)涉及到合成工藝流程的方方面面以及包括隨后的藥品的穩(wěn)定性和可能的降解雜質(zhì)，這是一個(gè)極其復(fù)雜的過程問題，因此對基因毒性雜質(zhì)的有效控制是不可忽視的。不得不承認(rèn)，基因毒性雜質(zhì)研究是一件非常富有挑戰(zhàn)性的工作，它涉及到工藝化學(xué)、毒理學(xué)數(shù)據(jù)采集分析、化學(xué)分析方法的建立和有效檢測，因此，我們要盡可能地明確藥品中存在的各類基因毒雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)、來源以及質(zhì)控限度，建立一個(gè)科學(xué)可行的分析方法，從而有效保證藥品的質(zhì)量安全。

本文根據(jù)以下文章進(jìn)行編輯整理，僅用于學(xué)習(xí)、交流：

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