近日，南方科技大學王杰課題組和北京大學陳鵬課題組合作在Nature Chemical Biology期刊上發表了文章A gasdermin-based life–death evolution system for reprogramming protease specificity，將蛋白酶的進化與宿主的生命周期偶聯，構建了一種基于“生死選擇”的高通量定向進化系統。并進一步通過該系統進化TEV蛋白酶，使其能識別并切割多種細胞靶蛋白。
蛋白酶通過切割酶原或前體蛋白生成新的生物活性分子，參與調控多種生理與病理過程，包括程序性細胞死亡、血液凝固級聯反應以及病原體感染等。重編程蛋白酶底物特異性，有望實現對目標蛋白的選擇性降解、特定信號通路的按需激活，甚至病理性蛋白的精準清除，從而衍生一系列在基礎研究與疾病干預中的革命性應用。
對標基因編輯工具對核酸序列進行靶向切割（或改寫），若能以類似的“可編程”理念重塑蛋白酶的底物特異性，使其識別并切割新的目標蛋白，將為蛋白質層面的精準編輯開辟全新路徑。與基因編輯需要識別15-18個堿基長度的核酸序列才可以在基因組上實現特異性不同，蛋白酶僅需要識別5-7個氨基酸長度的多肽序列就可以在蛋白組上實現特異性，而一個蛋白酶的口袋大小，通常在4-8個氨基酸范圍，因此，通過高效的定向進化方法，改變蛋白酶的底物特異性，有望實現蛋白質的靶向編輯。
天然蛋白酶的序列多樣性有限，難以滿足大規模、精確的蛋白質編輯需求。要實現這一目標，必須對天然酶的底物特異性進行系統性重編程。然而，要讓一種蛋白酶“改刀換刃”并非易事。蛋白酶識別底物的方式極為精細：它們依賴4–8個連續氨基酸殘基在空間和化學上的精確匹配，以定位切割位點。哪怕微小的識別序列改變，也可能擾動酶的整體構象或催化中心，導致活性喪失。傳統的定向進化方法雖然可以通過突變和篩選獲得部分改良的酶，但受限于通量和成本，難以在龐大的突變空間中快速篩選出理想變體，實現對不同序列的高特異性切割。這使得蛋白酶的特異性改造長期停留在“微調”階段，而難以實現真正意義上的重編程。
為了高效實現對蛋白酶底物特異性的重塑，研究團隊利用細胞焦亡的功能執行蛋白-Gasdermin D（GSDMD），構建了一種基于“生死選擇”策略的蛋白酶定向進化平臺。
首先，他們發現在原核生物中表達GSDMD的N端結構域（1-275，GD-N）可以對大腸桿菌的膜結構產生破壞，從而對其生長產生明顯的抑制。不僅如此，大腸桿菌的生長速度可以很好的受到GD-N的表達水平的調控，呈現出劑量依賴的效果，從而驗證GD-N是一個很好的篩選標簽。
隨后，他們在GD-N蛋白表面的loop區（R153-V163）插入了TEV蛋白酶的目標序列，通過篩選發現這一序列的引入不影響GD-N蛋白對大腸桿菌生長的抑制，進而實現對蛋白酶突變體的篩選：當蛋白酶突變體能識別并切割目標序列，毒蛋白GD-N的活性被破壞，細胞存活；當蛋白酶突變體不能識別目標序列，GD-N蛋白對細菌膜結構破壞，細菌生長受到抑制。
通過連續的培養，含有高活性突變體的大腸桿菌，生長速度較快，從而被富集，構建好的蛋白酶定向進化平臺可一輪篩選中，對高活性突變體可以實現百萬倍的富集效果。
圖1：基于GSDMD的蛋白酶定向進化平臺的建立與表征
研究團隊利用所建立的定向進化平臺，對TEV蛋白酶進行了系統進化，使其能夠特異性識別并切割來源多樣、結構復雜的內源性底物，包括膜蛋白CD22、線粒體蛋白ALAS1以及核蛋白EZHIP。其中CD22是一種B細胞特異性膜受體，通過抑制BCR信號維持免疫穩態，同時是B細胞相關腫瘤的重要治療靶點。ALAS1是血紅素生物合成途徑中的關鍵限速酶，其異常激活是Ⅰ型卟啉病的主要致病因素。EZHIP是一種位于細胞核的調控蛋白，通過抑制PRC2活性重塑H3K27甲基化圖譜，在維持發育可塑性及中樞神經系統腫瘤發生中發揮關鍵作用；其異常高表達可導致表觀遺傳失衡并促發彌漫性中線膠質瘤。
圖2：蛋白酶的特異性進化與蛋白質的靶向編輯
對于CD22靶點，研究者選取了其靠近細胞膜結構域的一段序列，該序列與TEV原始識別序列相比，在7個氨基酸中有5處發生了改變（ENLYFQS vs. EPVKVQH）。基于對底物不同氨基酸位點對特異性貢獻的分析，以及識別口袋中關鍵殘基在底物結合中的作用，團隊設計了TEV蛋白酶的進化路徑，并構建了滿足多輪進化需求的飽和點突變文庫，最終獲得了能夠高效切割目標序列的酶切活性突變體。
對于ALAS1靶點，研究者選取了HNIYVQA（551-557）作為目標序列, 研究團隊通過定向進化獲得了能夠特異性識別并切割ALAS1特定氨基酸序列的TEV蛋白酶突變體。在體外和體內實驗中，該突變體均表現出良好的序列正交性，未觀察到明顯脫靶效應。
對于EZHIP靶點，研究者選取了ERLAFQS（377-383）作為目標序列，研究團利用GSDMD進化平臺，僅一輪進化便獲得了能夠特異性酶切EZHIP的TEV突變體。該突變體在體外對EZHIP表現出明顯的切割活性；將其遞送至U2OS細胞后，能有效降低內源性EZHIP蛋白水平，同時顯著提高組蛋白H3K27Me3水平。
總之，這項工作建立的GSDMD定向進化平臺能夠高效重編程蛋白酶底物特異性，實現對多種內源性蛋白的精準切割。該平臺可在單輪篩選中實現百萬倍富集，顯著提高篩選效率；結合飽和點突變庫和底物-逐步策略，能夠覆蓋超過10?級別的蛋白酶突變體，充分探索突變空間。利用該平臺成功進化TEV蛋白酶切割膜蛋白CD22、線粒體蛋白ALAS1及核蛋白EZHIP，驗證了其在不同亞細胞環境下的普適性與可編程性。此外，該平臺可與多種蛋白遞送系統結合，實現內源性蛋白在活細胞中的定點切割，為蛋白質組水平的精確編輯提供強有力工具，同時為治療、診斷及功能研究應用奠定了基礎。
南方科技大學王杰教授和北京大學陳鵬教授為本文的共同通訊作者，南方科技大學博士后高子奇、李天真和研究生葉昊為本文的共同第一作者。深圳灣實驗室博士后魏書程和課題組成員王薈杰為共同作者。
DOI：10.1038/s41589-025-02063-3
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-02063-3
