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分享一篇最近發表在Biomacromolecules上的文章，題目為Understanding Biases in Liquid?Liquid Phase Separation: Investigating Amino Acid Enrichments in Phase-Separating Proteins toward Peptide Design。這篇文章的通訊作者是來自葡萄牙新里斯本大學的Ana S. Pina教授。

液液相分離(LLPS) 是細胞內形成無膜細胞器的關鍵機制，主要由固有無序蛋白/區域 (IDPs/IDRs) 驅動。為了解釋IDPs/IDRs如何驅動LLPS，學界提出了 “stickers-and-spacers” 模型，其中stickers是介導關鍵相互作用的氨基酸殘基，spacers是小側鏈的氨基酸來保證構象柔性，該模型強調，多價相互作用和序列模式（stickers與spacers的排列方式）是決定相分離行為的關鍵。

盡管“stickers-and-spacers” 模型非常成功，但其主要在朊病毒樣RNA 結合蛋白中得到驗證，這種研究對象的局限性導致該模型普適性仍然存疑，也限制了人們對LLPS的理解。在本文中，作者系統地分析了來自不同功能類別的178個相分離蛋白，旨在揭示超越RNA結合蛋白的、更普適的LLPS序列規律，并通過設計合成來驗證規律的可靠性（圖1）。

圖1. 本文工作示意圖。(1) 對相分離蛋白進行分析，以識別和表征重要肽基序；(2) 數據驅動LLPS肽的設計；(3) 濕實驗驗證

作者首先使用LLPSDB 和 PhaSePro 數據庫，篩選出 178個已驗證的相分離蛋白 (PhSePs)，并按功能分類，包括RNA 結合、DNA 結合、染色質結合、調控、水解酶和結構蛋白。為了確保有效性，作者還創建了一個負對照數據庫，包含 208 種發生相分離概率低于 20%的蛋白質 (non-PhSePs)。作者使用 FuzDrop 工具對PhSePs中的促液滴生成區域 (DPRs) 和非促液滴生成區域 (NODPRs) 進行了分析。相比于Full protein和NODPRs，DPRs中Gly、Ser、Pro和Ala都明顯增多，并且DPRs中極性氨基酸的比例增多，而疏水性和芳香性殘基的比例減少（圖2）。作者還用CIDER server分析了序列的參數，這些參數包括FCR（帶電氨基酸比例）、NCPR（平均殘基靜電荷）、κ（電荷分布情況）、hydropathy（疏水性）和促無序殘基比例。其中FCR、NCPR在DPR和NODPR中無差異，但κ有明顯差異，DPR中的κ值更高，與固有無序蛋白(IDPs) 數據集類似，表面電荷傾向于形成聚集 (cluster)。另外，疏水性和促無序殘基比例DPR和NODPR也有較大差異，DPR的參數與IDP的參數更類似。

圖2. 氨基酸富集情況。Full protein：包含PhSePs和 non-PhSePs數據庫；DPR和NODPRs：PhSePs數據庫

作者隨后分析了基序頻率，NODPR 區域的殘基呈現出顯著的隨機分布，相比之下，DPR 區域則傾向于表現出明顯更一致和豐富的模式。作者計算了長度為3至6個氨基酸的全部肽基序列 (Motif)，并計算了它們在DPR中的出現次數 (Presence) 和出現頻率 (總出現次數)；同時作者也在負對照數據集中重復了同樣的過程。作者通過一個組合評分 (CF, 0<CF<1) 來評估Motif相關性，包含了同等權重的PF（presence in DPRs of PhSePs/presence in non-PhSePs）和FF（frequency in DPRs of PhSePs/frequency in non-PhSePs）值。CF值大于0.2的Motif被認為是相關性高的Motif，作者一共發現了129個（圖3C）。

129 個Motif中，三肽占 2%，四肽占 54%，五肽占 31%，六肽占 13%（圖 3B），表明四肽可能為LLPS的最基本單元。根據平均 PF 和 FF 值，四肽出現的頻率最高，其次是三肽和五肽。六肽Motif的Presence較低，但是Frequency較高，表面在某些序列中出現了多次重復（圖3F）。從Motif中可以發現，其中存在著許多同源重復氨基酸如QQQQ、PPPP和GGGG，這些都是IDP內低復雜度區域的特征，表明它們在增強相分離所需的靈活性和動態性方面起著關鍵作用。其他的特點例如，Arg總是與Gly相伴出現，如RGGF、GGRS、GRGGY 和 GGGRGG；His總是與Gln和Pro一起出現如HHP、HQQQ；也存在純負電Motif如DDED、DEDD。這些反復出現的組合可能在促進蛋白質間相互作用起到了關鍵作用。雖然大多數Motif在前人工作中有報道，本文章發現了一些新的Motif包括HHP, QPN, PAPA, AAPA, SAPA, GAPG, GPGS, QQPP, QGPG, PSGP, PPQG, PPSS, SSDS, SSAP, DSSS, DDED, 和 DEDD。

圖3. A) Presence和Frequency的示意圖；B) 129個發現的肽基序的長度分布；C) 129個肽基序；D) 基序在PhSePs中存在(Presence)的比例；E) 肽基序CF值的分布；F) 肽基序Presence和Highest frequency分布

作者隨后探究了LLPS相關基序是否具有蛋白家族特異性。不同家族對基序長度的偏好不同。例如，RNA/DNA結合蛋白偏好更長的五/六肽，染色質結合蛋白則更偏好三/四肽，而調節蛋白則傾向于中等長度的四肽和五肽（圖4A）。并且不同家族的基序在存在性和頻率上展現出獨特的模式，例如RNA結合蛋白富含 RG/RGG Motif 和 YGG/FGG Motif；DNA結合蛋白富含 YSPTSPSY衍生Motif和 Ser/Gly-rich Motif；染色質結合蛋白富含帶正電的殘基Motif，利于與帶負電的DNA/組蛋白相互作用；調控蛋白富含 Gln-rich、Gly-rich 和 Pro-rich Motif，與轉錄激活域相關；水解酶Motif中含有催化殘基，暗示LLPS與酶活性的潛在關聯；結構蛋白中則富含 Val/Pro-rich Motif，與彈性蛋白樣多肽高度相似，負責彈性和相變。

圖4. 不同蛋白家族的motif情況

相分離是由蛋白中多個LLPS-prone Motif協同工作導致的，因此作者設想將那些在天然蛋白中經常一起出現的基序組合起來，設計成短肽，應該也能賦予其LLPS能力。作者首先從129個Motif中，選出所有可能的3個一組的組合，例如組合（Motif A, Motif B, Motif C），隨后計算它們共同出現的頻率，最終分數FS越高表明三者越容易共同出現。最后排列組合，生成了平均長度為12個氨基酸的短肽序列庫。隨后再用CIDER工具計算這些設計肽的物理化學參數，進一步篩選出序列特征最接近天然IDRs的肽段，形成最終的候選肽庫（圖5，表1）。

圖5. LLPS肽設計示意圖

表1. 設計得到的短肽序列

隨后作者實驗上合成了這些短肽，并驗證了它們形成液滴的能力，結果表明所有設計的肽段在1-10 mg/mL濃度下均能形成液滴；FRAP實驗表明所有液滴均具有液體特性（圖6），但恢復百分比差異顯著：高FS分數肽段恢復較慢，表明液滴內部相互作用更強，網絡更穩定。低FS分數肽段恢復更快，表明液滴流動性更好，分子交換更迅速。含Pro的肽段恢復率普遍更高，提示Pro可能通過引入扭結結構增強液滴流動性。