on style="max-width: 100%; box-sizing: border-box; color: rgb(62, 62, 62); white-space: normal; background-color: rgb(255, 255, 255); overflow-wrap: break-word !important;">“ 本文為美國德州農工大學（Texas A & M University） 化學系劉文設（Wenshe R. Liu）教授課題組最新發表的研究性論文，主要介紹了一種利用小分子硝基供體活化蛋白質中的半胱氨酸進而實現無內含肽介導的蛋白質連接技術。本文成功將一系列L/D-氨基酸以及肼連接至蛋白質內重組的半胱氨酸位點并進行了質譜表征，同時也展示了此方法在合成基于酶活性的蛋白探針和熒光探針、引入非天然氨基酸、自然化學連接技術、多肽藥物合成等方面的應用。”
半胱氨酸作為唯一一個側鏈含有游離態巰基的天然氨基酸，具有自然豐度低、側鏈親核能力強的特點。在自然界中，半胱氨酸在體內存在著一系列對細胞結構和功能具有重要作用的轉錄后修飾，這進一步佐證了其成為了一個理想的化學修飾位點的潛在應用能力。自1994年以來，隨著現代化學生物學的高速發展，科學家們提出了并逐漸完善了自然化學連接技術（native chemical ligation）、表達蛋白連接技術（expressed protein ligation）、酰肼連接技術（hydrazide ligation）等一系列基于半胱氨酸的蛋白質連接技術，這些技術的出現很大程度上為人工合成天然蛋白質創造了可行的條件。但是，這些現存的技術或多或少都存在一些缺陷，例如利用內含肽介導的方法無法保證合成出大量的蛋白質硫酯，作為重要的反應中間體的硫酯也具有不穩定、易水解的特點。因此，科學家們急需一種更簡單高效、不需要酶作為中間介質且可以應用于不同蛋白或多肽的蛋白質碳端功能化方法，以達到合成所需蛋白質以用于醫療及科研當中。
最近，美國德州農工大學（Texas A&M University）化學學院的劉文設（Wenshe R。 Liu）教授課題組提出了一種在水溶液中可以進行且不需要內含肽作為介導的表達蛋白連接技術。這種技術基于使用一種水溶性較好的氰基供體化合物2-硝基-5-硫氰基苯甲酸（2-nitro-5-thiocyanatobenzoicacid）活化半胱氨酸側鏈并生成1-酰基-2-亞氨基并噻唑烷中間體以降低半胱氨酸氮端羰基的電子云密度從而使其更容易被親核試劑進攻。通過向反應體系中提供不同的具有親核能力的含氨基小分子化合物，并改變R基團的組成，此技術理論上可以將任何官能團引入目標蛋白質中半胱氨酸-1位的氨基酸的碳端，以達到蛋白質碳酸功能化的目的。
圖1.基于活化半胱氨酸側鏈的蛋白質連接技術的反應及其機理
該論文首先利用有機合成獲得的含半胱氨酸的二肽進行了成功的測試反應，進而將其應用擴展至蛋白層面，利用泛素蛋白（Ub）為模型，嘗試并成功將9種不同的D/L-氨基酸和3種不同的含有官能團取代的小分子氨基化合物連接至泛素的G76C（甘氨酸變異成為半胱氨酸）變異體上。與此同時，為了證明半胱氨酸-1位蛋白質對反應的影響，G75位的不同氨基酸變異的泛素和77位半胱氨酸異變體也成功被證明可以很好地進行這種蛋白鏈接反應。另外，成功地將肼與Ub-K48C和Ub-K63C的蛋白異變體進行反應進一步證實了泛素蛋白游離的碳端不是促使反應發生的必要因素，為此技術的廣泛應用性提供了堅實的實驗基礎。
圖2. 利用泛素進行的基于活化半胱氨酸側鏈的蛋白質連接技術的測試
該論文接著介紹了利用基于活化半胱氨酸側鏈的蛋白質連接技術制備的基于酶活性的類泛素蛋白探針（activity-based probe）和熒光蛋白探針并將其結合Western印跡技術對蛋白質的功能進行分析。同時，此方法還可以用于引入通過正常非天然氨基酸引入技術難以企及的碳端修飾氨基酸例如組蛋白H2AK129酰基化，以及結合酰肼連接法進行RNA水解酶的蛋白質連接合成。另外，此方法還可以用于大量快速合成含有碳端修飾的藥用多肽，用以提高其產量與成本。
圖3. (A) 利用基于活化半胱氨酸側鏈的蛋白質連接技術制備的基于酶活性的類泛素蛋白探針與其對應的解離酶之間的反應；(B) 利用基于活化半胱氨酸側鏈的蛋白質連接技術制備的熒光蛋白探針的解離酶活性的熒光測試；(C) 利用基于活化半胱氨酸側鏈的蛋白質連接技術制備的組蛋白H2A碳端酰基化修飾引入； (D) 利用基于活化半胱氨酸側鏈的蛋白質連接技術結合酰肼連接法合成RNA水解酶RNH。
綜上所述，基于活化半胱氨酸側鏈的蛋白質連接技術可以被廣泛應用于在蛋白質碳端進行多種不同的修飾。其反應條件簡單、可控、溫和的特點有利于在最簡單的化學生物學課題組進行，對實驗條件沒有過分苛刻的要求。利用此技術進行蛋白質碳端的修飾，可以大大簡化蛋白質的合成步驟并擴展其應用至工業合成領域，也可以用更方便快捷的辦法幫助科研工作者得到實驗中所需要的蛋白質探針等重要研究材料。
相關工作發表在J. Am. Chem. Soc. (DOI: 10.1021/jacs.0c00252)，原文PDF版鏈接如下,或直接點擊最下方閱讀原文：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.0c00252
