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介紹的是最近在Nature Chemical Biology上報道的一篇標(biāo)題為“ELOVL6 activity attenuation induces mutant KRAS degradation” 的文章。該文的通訊作者是美國西北大學(xué)Feinberg醫(yī)學(xué)院的Shana O. Kelley教授。本研究通過全基因組CRISPR-Cas9敲除篩選發(fā)現(xiàn)了一種在KRAS多種類型突變體的功能調(diào)控中發(fā)揮作用的脂肪酸延長酶（ELOVL6），并將其開發(fā)為一種誘導(dǎo)KRAS突變體（主要是KRAS G12V）選擇性降解的抑制劑藥物用于腫瘤治療。

KRAS是胰腺癌、結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌等侵襲性癌癥中最常見的突變致癌基因，靶向KRAS突變的治療對開發(fā)新的癌癥療法至關(guān)重要。其中，G12位氨基酸是一個突變熱點，占所有KRAS突變的89%。迄今為止，取得較大成功的是KRAS G12C突變體的共價抑制劑，通過與半胱氨酸的共價交聯(lián)將蛋白構(gòu)象限制在GDP結(jié)合的非活性形式中，從而抑制下游信號傳遞。但使用該策略選擇性抑制蛋白質(zhì)功能并不適用于其他KRAS突變體，其中一些如KRAS G12V突變也具有極大的臨床價值。

鑒于KRAS G12V的靶向抑制難度和重要性，本文作者專注于識別和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)KRAS突變體水平的遺傳調(diào)控因子。通過細(xì)胞分選技術(shù)進行全基因組CRISPR-Cas9介導(dǎo)的敲除（KO）篩選，作者在野生型（WT）和KRAS G12V細(xì)胞系中尋找既能選擇性降低內(nèi)源性KRAS G12V前體蛋白水平又不影響WT KRAS的調(diào)控因子。篩選結(jié)果表明，脂肪酸延長酶ELOVL6是一種新型且具有選擇性的KRAS G12V調(diào)控因子。盡管ELOVL6此前已被發(fā)現(xiàn)與一些代謝疾病相關(guān)，但其與KRAS致癌突變的關(guān)聯(lián)尚未見報道。本研究證實，ELOVL6功能缺失會導(dǎo)致KRAS G12V蛋白選擇性降解、致癌信號減弱以及KRAS依賴性腫瘤細(xì)胞增殖抑制。并基于此開發(fā)了具備等位基因選擇性的抗KRAS治療藥物。

具體而言，作者團隊首先使用CRISPR-Cas9全基因組敲除SgRNA文庫（TKOv3）感染SW480（G12V）和HT29（WT）細(xì)胞，采用微流控磁性分選細(xì)胞術(shù)（MagRC）平臺根據(jù)KRAS蛋白水平進行分選，提取低表達KRAS細(xì)胞群體進行gRNA富集測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELOVL6是SW480細(xì)胞中特異性富集程度最高的基因之一，而在HT29細(xì)胞中無顯著富集。流式細(xì)胞術(shù)驗證ELOVL6敲除后，KRAS G12V蛋白水平顯著下降。（圖1）

圖1. 全基因組敲除鑒定KRAS-G12V突變體的特異性調(diào)控因子。

接下來，作者團隊據(jù)此重點研究了ELOVL6在癌細(xì)胞系中對KRAS G12V突變蛋白水平的影響。他們在SW480（KRAS G12V/G12V）、HT29（KRAS WT/WT）和NCI-H441（KRAS G12V/WT）上分別構(gòu)建了ELOVL6敲除系統(tǒng)，采用Western blot檢測KRAS總蛋白和G12V特異性蛋白水平。ELOVL6敲除導(dǎo)致KRAS G12V蛋白量下降50-80%，而WT KRAS無明顯變化。ELOVL6小分子抑制劑（ELOVL6i）處理也呈劑量依賴性降低KRAS-G12V蛋白。KRAS mRNA水平未受影響，說明調(diào)控發(fā)生在蛋白層面。（圖2）

圖2. ELOVL6的缺失或抑制誘導(dǎo)突變KRAS G12V的選擇性降解。

進一步地，作者研究了ELOVL6抑制后的KRAS信號傳導(dǎo)相關(guān)功能。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，ELOVL6敲除或抑制顯著降低了KRAS G12V細(xì)胞的增殖能力。Western blot實驗也表明了ELOVL6敲除或抑制劑作用能夠在KRAS G12V或其他突變細(xì)胞系上顯著降低結(jié)合GTP的活性KRAS亞型水平。表明ELOVL6影響KRAS的活性和下游信號傳導(dǎo)。（圖3）

圖3. 抑制ELOVL6可影響KRAS G12V的活性及下游信號功能。

接下來，作者團隊深度研究了ELOVL6影響KRAS突變體水平的機制。由于ELOVL6在長鏈脂肪酸的從頭合成中起重要作用，與硬脂酰輔酶A脫氫酶1共同催化棕櫚酸向硬脂酸和隨后向油酸的碳鏈延伸。靶向脂質(zhì)定量分析發(fā)現(xiàn)在ELOVL6抑制劑處理后，硬脂酸（C18:0）和油酸（C18:1）含量均出現(xiàn)了顯著降低。而外源補加硬脂酸或油酸則能在一定程度上救援細(xì)胞活力，表明脂質(zhì)匱乏是細(xì)胞致死的重要原因。隨后，作者團隊通過LC-MS/MS定量分析不同物種中不對稱磷酯酰絲氨酸（PS）的組成變化。結(jié)果表明，共六種曾被文獻報道為能穩(wěn)定KRAS膜錨定的不對稱PS組成出現(xiàn)下降。共聚焦成像結(jié)果也表明，添加了抑制劑后，能夠顯著影響KRAS G12V的表達水平和膜共定位指數(shù)。同時，向細(xì)胞中補充混合鏈PS也能夠挽救因ELOVL6敲除導(dǎo)致的KRAS水平降低。證明了ELOVL6抑制通過影響胞內(nèi)脂質(zhì)組分水平而降低KRAS的膜定位情況，從而導(dǎo)致KRAS的降解。（圖4）

圖4. ELOVL6i通過改變細(xì)胞脂質(zhì)組成影響KRAS G12V突變體膜定位。

隨后，作者團隊用共聚焦顯微鏡觀察了溶酶體抑制劑Bafilomycin A1和ELOVL6抑制后胞內(nèi)KRAS分布情況。結(jié)果表明ELOVL6i處理導(dǎo)致KRAS G12V從膜上解離并進入胞質(zhì)，聯(lián)合Bafilomycin A1處理后KRAS在胞質(zhì)中積累，表明其通過溶酶體途徑降解。綜合而言，ELOVL6抑制能夠顯著降低胞內(nèi)C18脂質(zhì)水平，從而使PS混合鏈的合成受阻，使KRAS無法成功識別上膜定位信號，最終形成內(nèi)體后被溶酶體降解。（圖5）

圖5. ELOVL6i通過溶酶體途徑將未定位的KRAS G12V突變體降解。

最后，作者團隊在KRAS G12V突變型異種移植小鼠模型（SW403、NCI-H441、CFPAC-1）中口服給予ELOVL6i，評估腫瘤生長和生存率。ELOVL6i顯著抑制腫瘤生長、延長小鼠生存期，并降低KRAS蛋白表達和ERK磷酸化水平。對30種KRAS突變細(xì)胞系的篩選顯示，ELOVL6i對多種KRAS突變（包括G12D、G13D等）均有效，尤其對KRAS依賴型細(xì)胞更敏感。（圖6）

圖6. ELOVL6i能夠在多種動物模型中產(chǎn)生抗腫瘤和多種KRAS突變體靶向抑制活性。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)脂肪酸延長酶ELOVL6是KRAS G12V突變體蛋白水平的選擇性調(diào)控因子。ELOVL6通過調(diào)控脂質(zhì)代謝，特別是混合鏈磷脂酰絲氨酸的合成，維持KRAS G12V在細(xì)胞膜上的定位。抑制ELOVL6可導(dǎo)致KRAS G12V膜定位喪失，并通過溶酶體途徑降解，從而抑制其下游信號傳導(dǎo)和腫瘤細(xì)胞增殖。該研究不僅揭示了KRAS G12V的代謝依賴性調(diào)控機制，也為開發(fā)針對G12V及其他KRAS突變體的廣譜治療策略提供了新靶點和理論依據(jù)。