論文DOI：10.1021/acscatal.0c00128 本研究通過對具有反應雜泛性的CYP72A63進行理性設計，從而控制其化學選擇性和區域選擇性，并通過匹配適當的氧化還原伴侶使其能特異性地合成多種稀有甘草三萜。眾所周知，甘草酸是一種來自甘草根部的天然產物，具有抗病毒、抗腫瘤等多種生理活性，是傳統中藥甘草的主要活性成分。甘草酸在甘草根中積累量較高（>2%），可以通過植物提取的方式獲得。然而甘草中還存在一些含量極低但同樣具有重要生理功能的稀有三萜包括甘草酸的中間產物甘草次酸、甘草次醇、甘草次醛以及甘草次醇的同分異構體等。除了具有重要的生理活性外，這些稀有三萜分子骨架上的羥基、醛基等功能基團的存在為對這一類分子進行化學修飾，從而獲得結構更加多樣、功能更加豐富的新型衍生物提供了可能。但是由于稀有三萜在植物中極低的含量以及復雜的分子結構，導致這類化合物難以制備。 P450標志性的氧化反應是C-H的羥化反應，修飾天然產物的P450也可以對C-H進行連續氧化形成羧基。在前期的研究中，李春教授課題組利用來自于苜蓿的CYP72A63在釀酒酵母體內合成了甘草次酸，但是由于CYP72A63催化的雜泛性，其在釀酒酵母體內可同時合成甘草次酸、甘草次醇、甘草次醛以及29-OH-11-oxo-β-香樹脂醇。雖然實現了稀有甘草三萜的合成，但是由于其結構相似性導致后期分離困難。要特異性獲得苷草次酸、甘草次醇、甘草次醛，需要精確地控制CYP72A63反應進程，改變其化學選擇性，使氧化反應停留在不同的產物上；而要實現29-OH-11-oxo-β-香樹脂醇的特異性合成則需要改變其區域選擇性。雖然目前可以通過重塑P450的活性口袋改變其區域選擇性，但是鮮有控制P450反應進程研究的報道，而且目前對于P450的改造主要針對晶體結構已解析的蛋白如P450cam。由于植物源P450為膜蛋白，不易獲得有功能的純酶，難以進行晶體結構解析與體外的酶功能驗證，因此對于膜結合P450氧化酶的研究較為困難。基于CYP72A63的雜泛性，李春教授課題組認為這是由于CYP72A63對不同的中間產物具有不同契合性的結果，要控制其反應進程就需要改變其化學選擇性，即控制其對于不同中間產物的契合性，比如要促進甘草次醇的合成就需要促進初始底物11-oxo-β-香樹脂醇的契合性同時降低甘草次醇的契合性以防止其進一步氧化。要控制其區域選擇性，就需要控制C-29和C-30相對于血紅素鐵的相對位置，使非目標基團遠離血紅素鐵。由于P450蛋白具有相似的空間架構，針對沒有晶體結構及體外驗證難以實現的問題，李春教授課題組基于同源建模和分子對接對CYP72A63進行了理性設計，同時利用釀酒酵母的體內驗證的方式對突變體的功能進行了驗證以解決體外試驗難以進行的問題。由于11-oxo-β-香樹脂醇的C-29與C-30與血紅素鐵的距離均在P450可氧化的范圍之內，且C-30比C-29更加靠近血紅素鐵，因此CYP72A63可產生少量的29-OH-11-oxo-β-香樹脂醇。由于甘草次醇對于野生型CYP72A63的契合性較差，其C-30羥基在疏水作用下被推離血紅素鐵，使其進一步氧化受阻，因此主要產物為甘草次醇。將11-oxo-β-香樹脂醇疏水的C-29推離血紅素鐵，需要降低CYP72A63活性口袋近端的疏水性以增加其與底物間的斥力作用；將甘草次醇親水的C-30羥基拉近血紅素鐵同樣也需要降低酶活性口袋近端的疏水性以降低底物與分子間的斥力。基于此，突變體CYP72A63（T338S）實現了11-oxo-β-香樹脂醇C-30的選擇性氧化，同時使甘草次醇的羥基更加靠近血紅素鐵，提高了其契合性，促進了甘草次醇的進一步氧化從而實現了甘草次酸的特異性合成。▲圖1. A）CYP72A63（T338S）與11-oxo-β-香樹脂醇的結構模型，B) CYP72A63（T338S）與1甘草次醇的結構模型，C) CYP72A63（T338S）氧化11-oxo-β-香樹脂醇的產物
對于野生型CYP72A63而言，其活性口袋近端對于11-oxo-β-香樹脂醇的契合性要顯著優于甘草次醇，要阻止甘草次醇的氧化需要進一步降低甘草次醇的契合性。酶活性口袋遠端底物通道入口的性質對于底物的識別與結合具有重要影響，為能夠在降低甘草次醇的契合性的同時盡量保持11-oxo-β-香樹脂醇的契合性，本研究在保留CYP72A63活性口袋近端不變的情況下，提高了活性口袋遠端的疏水性。鑒于此，獲得突變體CYP72A63（L509I）阻止了甘草次醇的進一步氧化，實現了甘草次醇的特異性合成。▲圖2 突變體CYP72A63（L509I）氧化11-oxo-β香樹脂醇的產物圖譜
特異性合成甘草次醛需要P450具有在醇和醛中間產物間的精確的化學選擇性，由于甘草次醇和甘草次醛在疏水性上的相似性，本研究通過對CYP72A63進行改造并未獲得理想的突變體。由于P450的活性受到其還原伴侶的影響，P450與CPR之間的相互作用不但會影響P450的活性還可能改變P450的構象從而影響其反應特性。李春教授課題組在前期研究中發現，一些被認為低效的還原伴侶蛋白與CYP72A63進行匹配時會顯著降低甘草次酸的產量而大量積累甘草次醇。本研究中，李春教授課題組通過將突變體CYP7A63（T338S）與一部分低效還原伴侶匹配，成功抑制了甘草次醛的進一步氧化，從而實現甘草次醛的特異性合成。▲圖3 突變體CYP72A63（T338S）與GuCPR2匹配時氧化11-oxo-β-香樹脂醇的產物譜
4. 29-OH-11-oxo-β-香樹脂醇的特異性合成通過對11-oxo-β-香樹脂醇與CYP72A63的對接模型分析發現，位于底物E-環兩側的L149與L398殘基對底物有一定的支撐作用，這兩個位點氨基酸側鏈的改變有可能會改變底物C-29與C-30相對于血紅素鐵的位置。基于此，本研究對這兩個位點分別進行了飽和突變，獲得突變體CYP72A63（L398I）使底物在活性中心中發生近180°的旋轉，反轉了C-30與C-29的相對位置，使C-30遠離血紅素鐵，實現了29-OH-11-oxo-β-香樹脂醇的特異性合成▲圖 4 A）11-oxo-β-香樹脂醇與野生型CYP72A63的對接模型，B) 11-oxo-β-香樹脂醇與CYP72A63（L398I）的對接模型，C) CYP72A63（L398I）氧化11-oxo-β-香樹脂醇的產物譜
在P450催化的氧化反應中，P450獲得電子和質子的效率影響著P450的氧化活性。由于提高了其質子傳遞效率，與野生型CYP72A63相比，突變體CYP72A63（T338S）氧化11-oxo-β-香樹脂醇產生的氧化產物總量提高了2.2倍。為進一步提高質子傳遞效率，本研究對質子傳遞途徑周圍的氨基酸進行分析，發現W205的大體積側鏈限制了K236的構象變化從而對質子傳遞有一定的限制作用。通過將其突變為低位阻的氨基酸，突變W205A解除了對質子傳遞途徑的限制，進一步提高了突變體的活性，促進了甘草次醇，甘草次醛和甘草次酸的合成。本研究通過基于同源建模與分子對接分析的理性設計，重塑了雜泛性的CYP72A63的催化特性。通過定點突變，利用一個雜泛性的酶構建了一系列具有特定功能的突變體，并利用其實現稀有甘草三萜的特異性合成。本研究提供了一種通過控制不同中間產物與P450契合性以及匹配氧化還原伴侶的策略來控制P450反應特性，該策略為精確控制P450催化的氧化反應進程，實現稀有天然產物尤其是一些難以積累的中間產物的合成提供了借鑒。同時，利用酵母體內驗證的方式對突變體進行驗證，為難以純化的植物P450的驗證提供了一種可行的方法。
