生物正交反應作為化學生物學研究中的一類重要的分子工具，近二十年來極大地推動了生物分子示蹤、蛋白質組學、代謝組學、藥物遞送等研究的發展。生物正交環加成反應是其中最為主要的反應類型，但已有的生物正交環加成反應往往采用張力烯烴或炔烴作為反應物，存在難于合成，穩定性差等問題。此外，現有反應種類有限，難以對復雜生理活動開展全面、系統的研究。因此，開發新型的生物正交環加成反應仍是當前研究中的一大熱點。
近日，南京大學張艷教授團隊和梁勇教授團隊合作開發了一種基于鄰二酮與當歸內酯類化合物之間的新型生物正交環加成反應（DFC）。該反應無需催化劑、環張力、光誘導，利用水的高極性（介電常數78.5）來穩定烯基氧負離子，作為一個極為富電子的環加成基團，使其可以與基態鄰二酮快速發生反應。該項工作的創新之處在于，結合理論計算與實驗驗證，首次提出了陰離子可以通過顯著增強過渡態分子間的靜電作用加速環加成反應在水溶液中的動力學，并且由于該反應與經典的環張力誘導的疊氮與炔烴的環加成反應（SPAAC）、逆電子需求的Diels-Alder反應（IEDDA）具有不同的反應機制，利用這三種反應可以實現對同一體系中不同蛋白質或細胞的三重正交標記，為同時研究復雜體系中的多種生物大分子提供了新的策略。
張艷教授團隊前期的研究結果表明激發態鄰二酮與富電子的非張力烯烴能發生環加成反應（J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 14542-14546）。梁勇教授團隊利用量子化學計算對基態鄰二酮PQ與一系列烯烴和炔烴的環加成反應活性進行了預測。計算結果表明，α-當歸內酯α-AL與鄰二酮PQ的環加成反應能壘高達33.7 kcal mol-1。而α-AL的共軛堿S2可作為陰離子環加成物與PQ反應，速率常數可高達7.3×105 M-1 s-1。考慮到α-AL的pKa約為12.1，在pH=7.4的緩沖溶液中，PQ和α-AL經由陰離子S2的環加成反應速率常數計算預測可達14.8 M-1 s-1。 實驗結果表明，室溫下鄰二酮PQ與α-AL在苯、氯仿等有機溶劑中不反應；在pH=7.4的緩沖溶液中測定的速率常數為10.7 M-1 s-1。這些結果與理論預測都相符。鄰二酮oD1與α-AL的環加成反應速率隨著反應體系pH的增加而加快，這也進一步證明了實際的環加成反應物為α-AL的共軛堿S2。同時，根據理論計算結果，PQ和α-AL對疊氮化合物、張力烯烴，如反式環辛烯（TCO）和張力炔烴，如二苯并氮雜環辛炔（DIBAC）都是惰性的。基于此，理論計算表明，DFC與SPAAC和IEDDA可作為新的三重正交環加成反應對。 實驗上，將菲醌基團oD1共價標記在SNAP-GFP融合蛋白的特定單個位點，再加入蛋白質1.5倍當量濃度的FuA-TAMRA與之反應，蛋白質二級質譜檢測到了反應的成功發生，并且反應在4分鐘內即可完成。由此說明了DFC反應在大分子上仍具有很高的反應效率。此外，將oD1或FuA基團分別標記在細胞膜表面的聚糖或蛋白質上，并進一步利用DFC反應實現了對細胞膜的熒光標記，標記反應在10分鐘內即可完成。 作者進一步將DFC反應與SPAAC、IEDDA反應同時用于同一體系中不同研究目標的正交標記。將不同反應的生物正交基團分別修飾在三種模型蛋白或三種模型細胞上，再與相匹配的另外三種修飾了熒光基團的生物正交官能團于同一試管中混合，膠內熒光分析及流式細胞術對蛋白質或細胞的熒光標記信號分析結果均顯示，利用DFC、SPAAC、IEDDA這三個反應可以成功實現同一體系中三種蛋白或三種細胞的正交標記。 總之，本文所開發的鄰二酮與當歸內酯類化合物的生物正交環加成反應，與經典的張力促進的生物正交環加成反應相比，具有完全不同的反應機制，從而可與SPAAC反應、IEDDA反應共同用于生物分子或細胞的正交標記。這一反應的設計與開發，為發展新型的生物正交反應提供了新的策略，并有望與其它的生物正交反應相結合用于研究復雜的生命體系。 論文信息 Metal- and Strain-Free Bioorthogonal Cycloaddition of o-Diones with Furan-2(3H)-one as Anionic Cycloaddend Ziwei Xi,Hao Kong,Yu Chen,Jiafang Deng,Wenyuan Xu,Prof.?Dr. Yong Liang,Prof.?Dr. Yan Zhang Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202200239
