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分享一篇發表在JACS上的文章，題目為“A Chemoproteomic Approach for System-Wide and Site-Specific Uncovering of Functional Protein N-Glycosylation”。文章的通訊作者是復旦大學的張瑩研究員和陸豪杰教授，他們的研究興趣都集中在翻譯后修飾的質譜分析方法。

熱蛋白質組學（TPP）技術將細胞熱位移分析（CETSA）與多重定量質譜分析相結合，允許了蛋白質熱穩定性的全局變化解析，并助力了很多內源相互作用的發現。然而，標準的TPP流程依賴于通過多個通道、多個溫度點的定量結果擬合求算溶解溫度變化（ΔTm），容易因采樣不足而遺漏低豐度蛋白或低化學計量的修飾；此外，這種逐個定量也使得整個TPP流程在操作上較為復雜。為了克服上述缺點，Zubarev等人在2019年提出了一種稱為蛋白質組積分溶解度改變（PISA）的替代方案（ J Proteome Res. 2019; 18(11): 4027-37），該方法跳過了經典TPP流程中的逐個溫度點定量，而是將溶解溫度范圍內的所有溫度點合并定量，通過計算擬合對應的曲線下面積（Sm）。這一方法極大地簡化了TPP的實驗操作，部分地解決了上述問題。

但隨著PISA的應用，人們發現ΔSm與ΔTm之間的線性關系不夠良好，尤其是在ΔTm值較大的情況下。在本文中，作者提出了一種進一步的改進方案，稱為Refined-TPP。該方法在低溫和高溫兩個范圍內定量曲線下面積，以面積比Rm = Sm/S0實現歸一化校正。作者在公共的TPP數據集上進行了基準測試，證明了與PISA相比，Refined-TPP方法能更真實地反映實際的ΔTm值。

隨后，作者將該方法應用于已知的HDAC抑制劑 panobinostat的藥物靶標分析。結果顯示，與傳統TPP方法相比，Refined-TPP方法能鑒定到額外的 1016 種潛在靶標。對于已知靶標HDAC6，ΔRm與ΔTm的鑒定結果高度吻合。值得注意的是，Refined-TPP方法也能鑒定到一些被傳統TPP方法遺漏的靶標，例如HDAC1，其具有非典型S形的熔解曲線，從而被TPP鑒定所遺漏，但在Refined-TPP鑒定中可被找回。

進一步地，作者將該方法應用于糖基化修飾的研究。作者提出了一種稱為糖依賴性熱轉移分析（GTSP）的策略，即將細胞裂解物按Refined-TPP流程制樣后，分別定量全蛋白質組或其中富集的糖蛋白，對于每種蛋白求算兩種組分之間的ΔRm。在這種策略下，預期那些具有功能的糖基化修飾將引起Rm的顯著變化。結果顯示，糖基化修飾的蛋白整體上具有更高的Rm，尤其是 113 個蛋白質的 208 個位點上的 N-糖基化顯著地提高了蛋白的熱穩定性，暗示這些糖基化修飾可能具有關鍵功能。作者成功驗證了其中一些糖基化修飾的功能，如EFNB2 N36 和 N139 上的N-糖基化穩定了蛋白結構，且改變了蛋白的細胞定位。又例如，NEU1 N352 上的 N-糖基化穩定了其結構，同時對其維持酶活性具有關鍵作用。