分享一篇發表在Mol Cell Proteomics上的文章：Native Top–Down Analysis of Membrane Protein Complexes Directly From In Vitro and Native Membranes[1]，文章的通訊作者是耶魯大學的Kallol Gupta。
細胞膜中蛋白質的大分子復合物是所有膜相關信號傳導事件的基礎。這些復合物的生物發生過程通常還會受到生物膜本身特定理化性質的進一步調控。因此，研究膜蛋白（MPs）最理想的方式是直接從其所在的生理膜環境中進行研究。近年來，非變性質譜（native mass spectrometry，nMS）已成為研究MPs的重要分析工具。然而，nMS分析MPs的一個突出瓶頸在于，常需要事先通過兩親性去垢劑將目標MPs從生物膜中移除。隨后，經過去垢劑溶解純化的目標MPs才能用于nMS分析。這從根本上限制了利用nMS直接從生理膜中研究MPs復合物的能力。在典型的去垢劑包埋MPs的nMS分析中，MPs通過碰撞誘導解離（CID）從去垢劑膠束中被剝離出來。然而，這種各態歷經的（ergodic）激發通常不足以解離生物膜，從而無法剝離整合膜蛋白（IMPs）或外周膜蛋白（PMPs）。此外，這種依賴于四級桿后CID剝離膜蛋白的方式，也限制了隨后通過四級桿分離和自上而下碎裂（top-down fragmentation）進一步鑒定被剝離蛋白的可能性，使nMS僅限于MS1級別的完整質量分析。作者最近發現，在電噴霧過程中，通過在噴霧溶液中加入少量增電荷試劑（supercharger），可以在氣相中特異性地削弱脂質分子層。利用這一現象，作者直接從完整的蛋白脂質體（proteoliposomes）中檢測到了MPs-脂質復合物，從而確定了MPs的功能組織形式和脂質結合特異性。在本研究中，作者進一步擴展了這一方法，開發出一種技術平臺，能夠通過非變性自上而下（native top-down，nTD）質譜分析，直接從細胞生理膜囊泡中檢測并鑒定內源性的蛋白復合物。
圖1A展示了該nTD分析平臺的實驗流程：先是通過源內活化從膜囊泡中噴射出MPs，通過四極桿隔離特定的蛋白質復合物，并對所選復合物進行nTD分析。考慮到CID 碎裂的各態歷經限制了大型天然蛋白質復合物的有效碎裂，這里用非各態歷經的（non-ergodic）電子捕獲解離（ECD）碎裂來補充CID，以提供EThcD的混合碎裂。ECD模塊安裝在四極桿和碰撞池之間，取消了傳輸多級桿。作者首先用三種IMPs評估了該方法的普適性。VAMP2、semiSWEET和AqpZ是重組的E.coli生理膜復合物，對應的寡聚體分別為單體、二聚體和四聚體，質量范圍為12~100 kDa。這里分別選擇了VAMP2、semiSWEET和AqpZ的單體、二聚體和四聚體進行nTD分析（圖1B~1D），均獲得了豐富的碎片離子。為了模擬真實情境下的未知蛋白鑒定，作者首先評估了用于蛋白鑒定數據的可靠性。為此，首先將VAMP2、semiSWEET和AqpZ的序列手動整合進E.coli蛋白數據庫，以驗證nTD流程能否正確鑒定這些MPs。隨后，利用ProsightNative將相應的MS/MS數據對修改后的E.coli數據庫進行檢索。在所有情況下，目標蛋白均以極低的P值被成功鑒定（VAMP2：8.6e?12；semiSWEET：2.5e?11；AqpZ：1.3e?33）。作者進一步通過人工驗證匹配的末端碎片離子來確認結果。三種蛋白均獲得了不錯的序列覆蓋率（VAMP2：43%；semiSWEET：71%；AqpZ：30%），并且所有蛋白的碎片離子均覆蓋了胞質區和跨膜區，表明該實驗平臺成功建立。接下來，作者將其應用于生理膜蛋白的分析。作者通過精確控制氮氣空化的壓力（750 psi），能夠直接從完整E.coli生理膜中制備出平均直徑約100 nm的均一膜囊泡（圖2A~2B）用于非變性質譜分析。相比于合成的蛋白脂質體（1000：1），生理膜中的脂質與蛋白質比（30：1~50：1）顯著減低，這也意味著需要更加溫和的增電荷條件。作者發現甘油不僅可以充當MPs的分子穩定劑，同時它也具有溫和的超電荷效應，可以提高MPs從生理膜中被剝離的效率。圖2C是E.coli完整膜囊泡的非變性質譜圖（5%甘油作為增電荷試劑），檢測到了非常多的MPs，質量范圍為16~500 kDa。
圖1. 體外脂質體MPs的nTD-MS分析。（A）nTD-MS分析平臺的示意圖；三種重組E.coli生理膜復合物的nTD-MS分析：（B）VAMP2、（C）semiSWEET和（D）AqpZ。
圖2. nMS分析從生理膜囊泡中的MPs。（A）氮氣空化前后的E.coli膜囊泡的電子顯微鏡圖；（B）從完整E.coli生理膜中制備出的膜囊泡的直徑；（C）膜囊泡的nMS分析。
圖3. 113, 113);">E.coli膜囊泡中內源性蛋白質的nTD和complex-up分析。（A~B）基于EChcD，對102.7 kDa的MP（25+）的nTD分析，及其序列覆蓋率譜圖；（C）102.7 kDa的MP的complex-up分析。
作者還考察了一種BAM復合物，其由BAM-A（IMP）及四個外周膜蛋白BAM-B/C/D/E組成的異源五聚體。在機體對抗革蘭陰性菌的過程中，BAM復合物（其他外膜蛋白的伴侶）已成為關鍵靶點。BAM 對于外膜的穩定性至關重要，廢除其功能會使機體易受細菌感染。目前沒有上市的抗生素針對BAM復合物，使其成為針對抗生素耐藥革蘭氏陰性菌的非常有希望的靶點。根據其異源五聚體的理論分子量，作者關注質量范圍為190~220 kDa的MPs。這里先是對候選MPs進行complex-up分析，以快速鎖定解離出與BAM亞基質量相匹配的MPs，然后再進行nTD分析。圖4A是BAM復合物的complex-up分析結果。經CID激活后，該復合物產生與各亞基質量完全吻合的亞復合物，也說明了該異源五聚體的解離過程是非對稱的。結合對亞復合物的complex-up分析，圖4B對BAM的去卷積譜圖也發現了多種脂質化的proteoforms，增加的質量對應棕櫚酸及油酸酰基鏈，它們是E.coli膜中最豐富的兩種脂肪酸鏈。將E.coli膜囊泡與100 μm MRL494（一種具有抗菌活性的合成小分子）在冰上短暫孵育后，在nMS譜圖中觀察到了BAM復合物出現了新的衛星峰，與對照實現相比，其質量對應于BAM復合物與MRL494的結合（圖4C），在complex-up實驗也觀察到了MRL494和無配體結合的BAM復合物的解離（圖4D）。該結果也首次為MRL494與BAM復合物在生理環境中的直接相互作用提供了直接證據。
圖4. BAM復合物及其配體的nMS分析。（A）BAM復合物的complex-up分析；（B）BAM復合物的去卷積譜圖；（C）BAM復合物與MRL494孵育的nTD分析；（D）BAM復合物與MRL494結合的complex-up分析；（E）BAM-E的序列覆蓋率譜圖。
總的來說，本工作建立了一種技術平臺，能通過nTD-MS直接從細胞生理膜囊泡中檢測并鑒定內源性的蛋白復合物：先是源內激活從膜囊泡中噴射出MPs，通過四極桿隔離特定的蛋白質復合物，對所選復合物進行nTD和complex-up分析，準確鑒定蛋白質及測定基于復合物的化學計量比。更重要的是，該方法可以用于研究生理膜上的MPs與藥物的結合/篩選。
當然，該分析平臺還有一些待提升的空間。MS1分辨率偏低且對超大復合物（約466 kDa）的解析暫無能為力，后續可借助基于Orbitrap的單離子質譜和多級串聯質譜策略去解決。由于缺乏前端的色譜分離，整個與MPs相關的蛋白質組都會進入質譜，造成一定程度的離子抑制，這也需要在上游進行干預來精確富集感興趣的生理膜囊泡，以更好地將nTD用于MPs及其復合物的檢測分析。
文章引用：Native Top-Down Analysis of Membrane Protein Complexes Directly From In Vitro and Native Membranes.
