β -內酰胺類抗生素聚合物雜質控制策略的形成與發展
ground-color: rgb(255, 255, 255); overflow-wrap: break-word !important;">中國新藥雜志 2020年第29卷第11期，微信來源：凡默谷對聚合物雜質的分析是當前β-內酰胺類抗生素雜質譜控制的最薄弱環節。控制聚合物雜質源于人們對β-內酰胺類抗生素過敏反應的關注。伴隨著β-內酰胺類抗生素過敏反應機制、聚合物結構和聚合機制等研究的深入，人們對β-內酰胺類抗生素聚合物的控制理念也逐漸成熟。采用專屬的ＲP-HPLC 方法，利用聚合物譜( polymer profile) 評價生產工藝; 同時，利用指針性聚合物控制聚合物的總量和工藝的穩定性，是控制β-內酰胺類抗生素聚合物的理想方案。利用強制聚合樣品，通過二維色譜-MS 聯用技術，可以快速建立ＲP-HPLC 聚合物譜分析方法，從技術上解決了聚合物譜控制的難題。但如何確定β-內酰胺類抗生素聚合物的質控限度問題仍需要進一步的思考。β-內酰胺類抗生素; 雜質譜; 聚合物; Sephadex G-10 凝膠色譜法; 高效凝膠色譜法; 高效液相色潽法; 質量控制對藥物雜質譜( impurity profile) 的控制是保證藥品安全性的重要環節，也是目前國內新藥研發的關鍵制約因素。β-內酰胺類抗生素作為臨床中最重要的一類抗菌藥物，是當前國內仿制藥一致性評價的熱點品種。由于自身結構的不穩定，β-內酰胺類抗生素產品中有機雜質( 有關物質) 種類復雜、含量較低且結構不穩定。針對β-內酰胺類抗生素雜質的特點，我們已經對其雜質譜研究中的共性策略與方法進行過討論［1］，基于計算機預測技術，以雜質結構為基礎建立了預測頭孢菌素雜質毒性的一般策略與方法［2］，并在國內被廣泛應用［3 － 4］。聚合物類雜質作為一類引發β-內酰胺類抗生素過敏反應的重要過敏性雜質，雖然不同時期國內已經有多篇綜述，對其特性、分離分析方法、質控策略等進行過討論［5 － 12］，但仍然是β-內酰胺類抗生素雜質譜控制中的最薄弱環節。伴隨科學技術的進步，人們對β-內酰胺類抗生素聚合物的認知不斷深入。本文以此為線索，通過闡述不同時期人們對β-內酰胺類抗生素聚合物認知的變遷，探討其聚合物雜質控制理念的形成過程，并結合分析技術的進展討論β-內酰胺類抗生素聚合物分析的發展方向，以期從整體上思考對該類雜質的分析控制策略。對β-內酰胺類抗生素聚合物的關注源自人們對青霉素過敏反應的關注。自20 世紀初青霉素被應用于臨床之后，就伴隨有青霉素過敏反應的發生［13］; 至1957 年約有多達1 000 人死于青霉素治療，即使在皮試過程中，少量的藥物也會導致患者發生過敏反應甚至死亡; 青霉素過敏休克是當時最嚴重的臨床不良反應［14］。但導致青霉素過敏反應的原因當時并不十分清楚。青霉素過敏休克屬于速發型過敏反應，即IgE 介導的Ⅰ型過敏反應(按經典的免疫學理論，Ⅰ型過敏反應通常分為2 個階段: 第1 階段，機體攝入抗原，產生特異的IgE抗體，抗體與肥大細胞結合分布于機體組織，使機體處于致敏狀態。第2 階段，當機體再次接觸該抗原或多價半抗原時，抗原與分布于肥大細胞表面的IgE 抗體結合，導致肥大細胞脫顆粒，釋放過敏介質，引發機體發生過敏反應。人們將能直接刺激機體產生抗體又能與抗體結合的物質稱為抗原( antigen)，但一般認為青霉素等小分子藥物僅是單價半抗原( hapten) ，本身不具有免疫原性，也不能引發過敏反應( 不具有反應原性) 。只有和蛋白等大分子載體結合形成抗原后，藥物分子才能刺激機體產生特異抗體，也才具有反應原性引發過敏反應。此外，藥物分子形成多價半抗原( 聚合物) 也具有一定的反應原性。因此，揭示什么是誘導機體產生青霉素特異抗體的抗原，什么是誘發青霉素速發型過敏反應的反應原，成為揭示青霉素過敏反應原因的關鍵。1966 年，青霉素過敏反應研究取得重大突破。Levine 首次提出了半抗原模型用以揭示藥物過敏反應的免疫學機制。認為青霉素與蛋白質結合形成的青霉噻唑蛋白( penicilloylated protein) 是導致青霉素過敏反應的過敏原［15］。之后，在青霉素及6-APA 產品中均發現了青霉噻唑蛋白類雜質，并證明其在發酵工藝中形成，是誘導機體產生特異性抗體和引發青霉素過敏反應的過敏原［16］。對青霉素與蛋白質結合機制的研究揭示，蛋白質通過自由氨基與青霉素β-內酰胺環的羰基反應，形成的青霉噻唑蛋白結構是穩定的抗原決定簇( 見圖2) ［17 － 19］。
雖然后續的研究發現半抗原在體內也可以與機體蛋白結合形成抗原，或在特定的條件下通過其他機制直接誘導T 細胞發生免疫應答反應產生抗體［20］，證明青霉噻唑蛋白類雜質不是機體產生青霉素抗體的必要條件，但減少青霉素制劑中青霉噻唑蛋白類雜質的量可顯著降低臨床過敏反應的發生率。
我國曾于1973—1975 年間，用商品青霉素及精制青霉素進行過10 萬余例的青霉素臨床過敏反應研究，商品青霉素的過敏休克率較1968 年世界衛生組織報道的過敏休克率高( 0． 015% ～ 0． 04%) ，而精制后的青霉素，由于青霉噻唑蛋白含量顯著降低，肌注后過敏反應發生率較商品青霉素顯著降低( 0． 012%) ［21］，證實了青霉噻唑蛋白類雜質是早期青霉素過敏反應的重要過敏原。見圖1) 。
當青霉素過敏反應機制被逐漸闡明后，青霉噻唑蛋白是否是青霉素過敏反應中的唯一過敏原這一問題逐漸引起人們的關注。對青霉素聚合物的研究起始于20 世紀60 年代末，受當時分析技術的限制，利用凝膠結合動物被動皮膚過敏( PCA) 試驗，判斷樣品組分是否可以引發過敏反應是較常見的研究方法。高濃度的青霉素( 青霉素鈉、羧芐西林鈉、氨芐西林鈉和6-APA 等) 水溶液，經放置后，利用Sephadex 凝膠分離kav值較小的組分( 分子量較大的組分) ，它們均可以引發動物PCA 陽性反應。上述結果提示，青霉素類藥物可以形成聚合物，青霉素聚合物同樣是重要的過敏性雜質［22 － 24］，控制其在藥品中的含量是減少臨床過敏反應的有效手段。對青霉素聚合物結構的認知主要來自20 世紀70 年代初Bundgaard 對6 位側鏈含有氨基的青霉素如氨芐西林、阿莫西林的研究［25 － 28］，其聚合反應機制被認為是藥物分子中的自由氨基攻擊另一分子β-內酰胺環的羰基［25 － 26］。通過DEAE-葡聚糖凝膠A-25 離子交換樹脂，從氨芐西林聚合樣品中分離出二聚體、三聚體、四聚體和五聚體，利用動物PCA 試驗證明聚合物的最基本單元二聚體就能引發過敏反應［29］，進一步證明了控制青霉素聚合物的重要性。我們曾利用Sephadex G-10 凝膠色譜結合動物PCA試驗證明，在噴霧干燥工藝和溶媒結晶工藝生產的氨芐西林中，聚合物成分不同，它們引發動物PCA反應的能力也有差異［30］，提示致敏性雜質與生產工藝相關，但受當時分析手段的限制，這種差異的原因并沒有被真正揭示。對6 位側鏈不含氨基的青霉素聚合物的研究一直較少。20 世紀90 年代初，我們利用Sephadex G-10 凝膠收集氨芐西林和羧芐西林中的寡聚物組分，再利用FAB-MS 分析其分子量，推測它們的可能結構。發現氨芐西林的寡聚物中含有閉環和開環二聚體、三聚體等。羧芐西林的寡聚物中主要含3 種不同的二聚體( m/z = 774) ，推測其是L 和D 型異構體的同聚和異聚產物。根據當時對青霉素聚合反應機制的認知，認為羧芐西林的聚合反應僅與母核結構有關［31］。推測β-內酰胺環首先開環，形成具有親核攻擊能力的仲氨基結構，再與另一分子藥物β-內酰胺環的羰基發生反應。然而，根據目前對青霉素聚合反應機制的認知，發生這種聚合反應的可能性較小，羧芐西林二聚體( m/z = 774) 更可能是一個分子中的羧基攻擊另一分子的β-內酰胺環形成的聚合產物。1996 年，依據對青霉素類抗生素聚合反應的認知，我們首次將青霉素聚合反應分為2 類: ① 僅和母核結構有關的聚合反應，側鏈中的活性基團不參與反應。② 側鏈參與的聚合反應，主要以氨芐西林等為代表，通過側鏈上的氨基攻擊另一分子β-內酰胺環的羰基形成聚合物［6］。后來在探討頭孢菌素的聚合反應時，又將這2 類聚合反應分別稱為N 型聚合反應和L 型聚合反應［32 － 33］。雖然L 型聚合反應在后來的研究中被證明普遍存在［10］，氨芐西林、阿莫西林的經典L 型聚合反應產物( 閉環、開環聚合物) 在各國藥典中均被收載，但青霉素類抗生素的N 型聚合反應機制一直未被合理解釋。理論上所有青霉素類藥物均應能發生N 型聚合反應。Ｒaj 等［34］在研究雙氯西林的降解反應中發現，化合物的羧基可以攻擊β-內酰胺環形成N-酰基化產物，據此我們推測青霉素的N 型聚合反應可能是分子母核的羧基與另一分子β-內酰胺環的反應［35］。此外，歐洲藥典( EP) 和美國藥典( USP) 在苯唑西林鈉和替卡西林鈉各論中還分別收載了6-APA 通過氨基與青霉素分子的羧基反應形成的異聚體結構。在哌拉西林鈉各論中收載了氨芐西林通過氨基與哌拉西林的羧基反應形成的二聚體結構，提示分子間羧基與氨基的酰化反應也是一種可能的聚合方式。我們對青霉素類藥物的各種可能聚合反應途徑進行了匯總( 見圖3) 。
認為N 型聚合反應( 以青霉素為例) 包括聚合反應I( 藥物的2 位羧基與另一分子藥物β-內酰胺環的反應) 和聚合反應Ⅱ( 一分子藥物β-內酰胺開環形成的羧基與另一分子藥物β-內酰胺環的反應) 2 種反應途徑，L 型聚合反應( 以氨芐西林為例) 還包括聚合反應Ⅲ( 藥物側鏈的氨基與另一分子藥物β-內酰胺環的反應) 和聚合反應IV( 藥物側鏈的氨基與另一分子藥物2 位羧基的反應) 2 種反應途徑。
因此，對側鏈含有自由氨基的青霉素的聚合反應，理論上存在4 種反應途徑。我們首先通過計算化學的方法模擬各反應途徑，計算各自的反應活化能，推測反應發生的難易程度。再利用LC-MS 方法分析模型化合物( 青霉素和氨芐西林) 強制聚合溶液中的二聚體結構，對理論計算結果進行驗證。研究表明，4 種反應途徑理論上均可以發生，但反應的活化能不同，即反應難易程度不同。對N 型聚合反應，聚合反應Ⅰ的反應活化能較低為優勢反應，提示實際產品中由聚合反應Ⅰ形成的聚合物應占多數。LC-MS 分析青霉素強制聚合樣品中的二聚體，發現由聚合反應Ⅰ形成的二聚體是主要聚合產物。對6 位側鏈含有氨基的青霉素類藥物，理論計算提示聚合反應Ⅲ是最容易發生的聚合過濾的分子排阻原理，反應，在氨芐西林強制聚合樣品中，由聚合反應Ⅲ形成的二聚體是主要聚合產物［35］。這也較好地解釋了實際產品中經典的氨芐西林、阿莫西林L 型聚合產物( 二聚體、三聚體) 是主要聚合物［36］對頭孢菌素聚合物的研究同樣基于人們對頭孢菌素過敏反應的關注。頭孢菌素可以發生過敏反應，甚至過敏性休克反應，但發生率較青霉素低［38］。鑒于頭孢菌素均由半合成生產，由發酵來源的蛋白結合物類雜質幾乎可以忽略，基于對青霉素過敏反應的認知，人們對頭孢菌素過敏性雜質的研究主要集中在對其聚合物的研究。20 世紀80 年代初，采用與青霉素聚合物研究相同的理念，先后從頭孢噻吩鈉和頭孢噻肟鈉中分離出可以引發動物PCA 陽性反應的過敏性雜質［39 － 40］。采用凝膠色譜法，利用蛋白標準測定雜質的分子量，認為頭孢噻吩聚合物的平均分子量為6 580［39］，頭孢噻肟聚合物的平均分子量為7 210［41］。雖然后來證明這種測定方法存在較大的偏差，但當時誤導人們認為頭孢菌素易形成具有較高聚合度的高分子聚合物雜質。為了解頭孢菌素的聚合反應特性，我們曾利用Sephadex G-10 凝膠色譜法分析頭孢菌素聚合物組分( Kav = 0 組分) ，通過比較不同頭孢菌素和其聚合物組分UV 光譜的差異，探討頭孢菌素結構和其聚合反應關系［32 － 33］，以及固體狀態下水分、溫度等因素對頭孢菌素聚合反應的影響［42］。結果顯示，頭孢菌素可發生N 型和L 型聚合反應; 7 位側鏈不具有自由氨基的頭孢菌素只能發生N 型聚合反應，所形成的聚合物中保留有7 位側鏈結構，但3 位取代基結構消失; 7 位側鏈含有自由氨基的頭孢菌素，在酸性條件下主要以N 型聚合反應為主，在堿性條件N型聚合反應和L 型聚合反應可以同時發生，2 類聚 － 37］這一現象。合反應的相對強度與化合物本身的結構有關［32］。頭孢菌素的3 位側鏈及7 位側鏈結構均可影響聚合反應速度［33］，固體條件下，樣品的水分是影響聚合的關鍵因素，水分-溫度對其聚合反應具有明顯的交互作用［42］。雖然受當時對頭孢菌素聚合物認知的影響及分析技術的限制，這些結論現在看來并非完全正確，但據此認為頭孢菌素聚合物具有高度的不均一性這一觀點，對后來形成β-內酰胺類抗生素致敏性雜質控制理念具有重要的影響。利用現代波譜學技術解析頭孢菌素聚合物結構的研究直至20 世紀90 年代初才有報道。對頭孢噻肟在偏堿性溶液( pH 8． 5) 中的聚合物進行分離，采用質譜、核磁等波譜學方法，發現二聚物的分子量為910，聚合樣品中未發現其他多聚物［43］; 對7 種頭孢菌素( 頭孢唑肟鈉、頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、頭孢替安、頭孢孟多鈉、頭孢唑林鈉和頭孢噻吩鈉) 水溶液( 10% ～ 50%) 中的聚合物進行研究，僅分離出頭孢噻肟和頭孢唑肟二聚物［44］，根據頭孢噻肟、頭孢唑肟二聚物的結構，認為其是頭孢噻肟7 位側鏈噻唑環上的自由氮基攻擊另一分子β-內酰胺環的反應［43 － 44］。不含有自由氨基的頭孢菌素或含有氨基但其空間或電荷位阻較大時不宜發生聚合反應［44］。上述結果不僅說明利用凝膠色譜法測定頭孢菌素聚合物的分子量存在較大的偏差，也提示頭孢菌素可能不易形成聚合度較高的聚合物雜質。頭孢菌素與青霉素結構的主要差別在于其含有3 位側鏈，因此理論上青霉素具有的4 種聚合反應途徑在頭孢菌素聚合反應中均可發生。但頭孢菌素的3 位側鏈及6 元環結構更不穩定，已有研究表明，在頭孢菌素-蛋白結合物中，頭孢菌素的結構可發生多種改變( 見圖4) ［45］，這些改變理論上在頭孢菌素聚合物中同樣可能發生。此外，歐洲藥典還給出了頭孢噻肟和頭孢西丁脫去3 位側鏈形成的二聚物結構( 見圖5) ，提示頭孢菌素的3 位側鏈也是一個聚合反應活性位點。
上述結果提示對頭孢菌素聚合物結構的分析較青霉素更加困難。LC-MS 技術的應用與普及使得頭孢菌素聚合物具有高度不確定性的神秘面紗被逐漸揭開。雖然頭孢菌素具有多個聚合反應位點和多種不同的聚合反應途徑，但對一個具體品種，通常只能發現一種主要聚合產物，如在頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑肟和頭孢泊肟酯等品種中主要是聚合反應Ⅲ( 一分子藥物側鏈的氨基與另一分子藥物β-內酰胺環的反應) 的產物［46 － 47］。在頭孢噻肟鈉中主要是氨噻肟結構中的氨基與3 位側鏈的聚合產物，而不是聚合反應Ⅲ的產物［46］。
其他含有氨噻肟結構的頭孢菌素如頭孢曲松鈉、頭孢他啶、頭孢甲肟和頭孢吡肟等均存在與頭孢噻肟鈉類似的現象( 未發表資料) 。而在頭孢唑林鈉、頭孢替唑鈉中僅發現有聚合反應Ⅰ( 一分子母核的羧基與另一分子β-內酰胺環的反應) 的產物，且含量較低( 未發表資料) 。不同品種中聚合物的種類和含量與其分子結構和生產工藝有關，如頭孢噻肟鈉、頭孢他啶、頭孢甲肟等產品，一般僅能檢出少量的主要二聚體; 部分品種甚至可能檢測不到聚合物，如頭孢地尼等，但產品中聚合降解物的種類可反映其工藝及工藝控制水平( 未發表資料) 。20 世紀80 年代初，碳青霉烯類抗生素開始應用于臨床。雖然后來證明碳青霉烯類抗生素在臨床中的過敏反應低于青霉素和頭孢菌素［48］，但基于對β-內酰胺類抗生素過敏反應的傳統認知，加之科學技術的進步對藥品注冊要求的提高，使得人們對碳青霉烯類抗生素聚合物的認知更為全面。亞胺培南在弱酸性溶液中的聚合反應發生在母核的羧基與β-內酰胺環之間［49］。美羅培南在溶液中的聚合反應為側鏈中的仲氨基與β-內酰胺環的反應，β-內酰胺環開環后可形成一對非對映異構體( 二聚體A，B) ; 二聚體A 在酸性和堿性溶液中均能產生，而二聚體B 主要在中性溶液中產生［50］; 但即使是在固體高濕條件( 相對濕度75%) 下，在美羅培南樣品中也僅能檢測到三聚體［51］; 從厄他培南中，已經分離鑒定出了按不同聚合反應途徑形成的多種聚合物( 見圖6) ，其不僅豐富了碳青霉素類抗生素的聚合反應途徑，也是對青霉素、頭孢菌素聚合反應途徑的重要驗證。
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明確藥品的質量控制目的和對象是形成藥品質控策略和開發藥品質控方法的關鍵。對β-內酰胺類抗生素聚合物的控制是為了減少臨床中的過敏反應。鑒于對β-內酰胺類抗生素過敏反應的認知，藥物中的高分子雜質是引發過敏反應的過敏原［5］，因此β-內酰胺類抗生素中的高分子雜質被認為是關鍵質控對象。β-內酰胺類抗生素中的高分子雜質包括青霉噻唑蛋白和聚合物2 類， 1996 年我們首次對其進行定義: 是對藥品中分子量大于藥物本身的雜質總稱，分子量一般在1 000 ～ 5 000 Da，個別可至10 000 Da 左右。按其來源可分為外源性雜質和內源性雜質: 外源性雜質主要來自于發酵工藝，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。內源性雜質系對抗生素寡聚物和多聚物的總稱，并認為隨著藥品生產工藝的不斷改進和提高，產品中外源性雜質日趨減少，因此對內源性聚合物雜質的控制是重點［6］。這一質量控制理念后來被普遍接受［7 － 12］，并一直主導著國內β-內酰胺類抗生素聚合物分析技術的發展。后來，隨著藥物分析技術的發展，β-內酰胺類抗生素的異聚體和聚合降解產物被逐漸發現，目前普遍認為β-內酰胺類抗生素中的高分子雜質可分為3 類:外源性雜質、內源性雜質和其他來源的雜質( 指非藥物分子的自身聚合產生，而是合成或使用過程中產生的高分子副產物或者高分子雜質降解產物) ［11 － 12］。根據當時對β-內酰胺類抗生素高分子雜質的認知: ① 青霉噻唑多肽( 蛋白) 類雜質: 發酵中產生的任何蛋白或蛋白碎片都可能帶入到產品中; 相同的蛋白或蛋白碎片上可以結合不同數目的藥物分子。② 聚合物類雜質: 青霉素、頭孢菌素不僅能形成聚合度不同的聚合物，還能同時發生不同機制的聚合反應。③ 形成的聚合物可發生不同程度的降解。④ 對以異構體形式存在的樣品，同聚和異聚反應可同時發生。⑤ 產品中高分子雜質的種類及數量和生產工藝密切相關。我們提出了2 種質控策略: ① 控制高分子雜質的總量，無需分別控制不同結構的高分子雜質的含量，因為它們均是過敏性雜質。② 控制樣品中特定“信號雜質”的含量，當認識到某個特定雜質和高分子雜質具有明確的相關性時，則可將該雜質作為“信號雜質”，通過控制“信號雜質”的量，控制藥品中高分子雜質的總量。結合當時的分析技術水平，認為采用凝膠色譜法控制高分子雜質的總量是方便可行的方法［6］。該理念后來一直被《中華人民共和國藥典》和國內新藥注冊所接受［8］，并一直主導著對β-內酰胺類抗生素中高分子雜質分析方法的研發方向［7 － 12］。鑒于USPXXIII 中( 1990 年) 收載頭孢他啶高分子雜質檢測項時稱之為“high molecular weight ceftazidime polymer( 頭孢他啶高聚物) ”，《中華人民共和國藥典》2000年版收載Sephadex G-10 凝膠色譜法控制β-內酰胺類抗生素中的高分子雜質時，將該檢測項被稱之為“聚合物”。進入21 世紀，伴隨著藥品雜質譜( impurity profile)控制理念的逐漸成熟，加之藥物分析技術的進步，依據雜質的生理活性逐一制定每一個雜質限度的理念被逐漸接受。與此同時，采用凝膠色譜法控制高分子雜質總量的策略不斷受到挑戰，特別是凝膠色譜法專屬性問題［52 － 54］，使得利用指針性雜質控制高分子雜質的理念再次受到關注［10］。近年采用反相高效液相色譜方法( ＲP-HPLC) 分析常用β-內酰胺類抗生素聚合物的研究越來越多，這不僅解決了凝膠色譜法專屬性差等問題［46 － 47， 52， 55］，也顯示出通過精準控制指針性雜質，可以將β-內酰胺類抗生素有關物質分析與聚合物分析相統一［36 － 37， 52， 55］，而產品中的聚合物譜( 種類與含量，包括聚合降解物的種類) 與具體產品的工藝及工藝控制水平相關，也為按質量源于設計( QbD) 理念評價產品工藝及工藝控制水平提供了工具。由此可見，采用專屬的ＲP-HPLC 方法，通過對具體品種聚合物譜( polymerprofile) 的系統研究，利用聚合物譜對生產工藝進行評價; 同時，利用指針性聚合物( 通常是具體品種中最易產生反應的一種二聚體) 控制聚合物的總量和工藝的穩定性，將聚合物控制與工藝控制相關聯，是最理想的質控方案，也是目前仿制藥一致性評價中β-內酰胺類抗生素聚合物控制的發展方向。
