一、萃取技術介紹及實施例

溶劑萃取有多種形式，瓶振搖法，向樣品中加入溶劑并振搖，當被測物在提取溶劑中的溶解度很大且樣品孔多時，這一工作很容易。對于快速萃取來說，應將樣品研磨分散，超聲或加熱提取，使提取效率最大化，通常提取效率不得低于80%。

實際應用—頭孢噻肟中冰醋酸測定案例

頭孢噻肟鈉本身在頂空平衡過程中也可能分解產生乙酸，造成測定結果過高，無法真實反映樣品中乙酸的殘留量，采用環己烷作為溶劑進行固液萃取，因為頭孢噻肟鈉不溶于環己烷，而乙酸可溶于環己烷，渦旋混合器振動后，頭孢噻肟鈉中的乙酸就游離至環己烷中，過濾掉頭孢噻肟鈉粉末，即可檢測濾液中的乙酸。

二、衍生化技術介紹及實施例

在液相色譜法中，紫外吸收檢測器是最常見的一種高靈敏度檢測器。但是有很多化合物在紫外可見光譜區沒有吸收，而不能被檢測。將它們與帶有紫外吸收基團的衍生試劑在一定條件下發生反應，由于反應產物帶有發色基團而能被檢測。

1、   胺類化合物的衍生化

胺的化學性質與其氮原子上有兩個未成對的電子有關。胺具有親核性，易與親電性的化合物發生反應，即容易與鹵代烴、羰基化合物、酰基化合物、酸等發生反應，因此它們常用作胺類化合物的衍生試劑。

（1）      鹵代烴衍生化試劑  2,4-二硝基氟苯（FDNB）的對位、鄰位上硝基的存在使爐鹵原子更加活潑，容易發生反應。這種試劑主要與仲胺發生衍生化反應，因此常用于仲胺的鑒別。

（2）      酰氯類衍生化試劑  苯甲酰氯及其衍生物對硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯和對甲（氧）基苯甲酰氯可以與胺類、醇類和酚類化合物反應生成強紫外吸收的苯甲酸酯類衍生物。典型的反應如下：

對硝基苯甲酰氯適用于伯胺的衍生化反應。一種雙胍化合物能同對硝基苯甲酰氯生成適合紫外檢測的S-三氮雜苯環衍生物。

對甲基苯磺酰氯的衍生反應為

（3）      N-琥珀酰亞胺對硝基苯乙酸酯  該試劑與仲胺反應生成對硝基苯乙酰胺。

2、   α-氨基酸的衍生化

（1）      異硫氰酸苯酯（PITC）  與氨基酸生成苯基乙內酰硫脲衍生物，即PTH-氨基酸。PTH氨基酸在酸性條件下是穩定的，故用作蛋白質酸解時測N-末端氨基酸，對于多肽的序列測定十分有用。PTH氨基酸可借助吸附或反相分配色譜分離，紫外260nm檢測限量可達5×10-11mol。PITC與伯胺或仲胺氨基酸反應，反應方程式如下：

實驗操作是將氨基酸溶于含60%吡啶及適量異硫氰酸苯酯的水溶液中，并在40℃微熱1h，即生成PTH氨基酸。然后在反相ODS柱上，或正相硅膠柱上分離。因為整個反應過程比較長，用該衍生試劑時，一般都采用柱前衍生的方式。

（2）      茚三酮  茚三酮是常用的定量測定氨基酸的柱后衍生試劑。經色譜柱分離后的氨基酸在130℃時與茚三酮反應。伯胺氨基酸的衍生產物在570nm處都有最大吸收，所以利用紫外檢測。同樣也可以檢測蛋白質和多肽等化合物。

另外，仲胺氨基酸如脯氨酸及羥基氨基酸生成的衍生產物的最大吸收在440nm。

3、   羧酸的衍生化

羧酸很容易同酰溴基反應生成酯。衍生試劑有苯甲酰溴、對硝基苯甲酰溴、對氧基苯甲酰溴和對溴苯甲酰溴等。羧酸的衍生化條件與一般酸的酯化有些不同，可以先將欲衍生的酸制成它的鉀鹽，然后以冠醚為催化劑，鉀離子進入冠醚結構內，在冠醚外邊的RCOO-基與鹵代烴反應，這樣形成的酯的產率在90%以上。酯化反應在極性有機溶劑（乙腈、內酮或四氫呋喃）中進行，還可加入三乙胺、N，N-二異丙基胺等催化劑。該衍生化法應用于測定脂肪酸、前列腺素、青霉素和二丙基醋酸等。

1-萘重氮甲烷與C10與C18脂肪酸和某些極性、非極性膽汁酸反應，衍生物在紫外250~280nm范圍內檢測，可用吸附色譜法分離。

4、   羥基的衍生化

由于酰氯的化學性質很活潑，容易與親核試劑發生反應，它不僅是胺類化合物的衍生試劑，同時也是羥基化合物的衍生試劑。常用的衍生試劑有3,5-二硝基甲酰氯、對甲氧基苯甲酰氯。

過量的試劑通過水解很容易除去，反應產物用有機溶劑提取，然后直接進樣，吸附或反相分配色譜分析。這些衍生物的紫外吸收值與苯環上的取代基及其所處位置有關。對于多羥基化合物，可接上多個苯甲酸基團，其紫外吸收值的大小正比于衍生反應接上的苯甲酸基團的樹木。例如，脫乙酰洋地黃苷C可以接上8個對硝基苯甲酸基團，紫外吸收值高達1.2×105。

5、   羰基的衍生化

醛類和酮類化合物與2,4-二硝基苯肼（DNPH）生成苯腙衍生物，反應在弱酸性條件下進行。

該反應速度快而且反應完全，靈敏度高。甾酮、酮酸以及其它羰基化合物都可用此法反應。對硝基芐基羥胺（PNBA）與醛類、酮類反應生成紫外吸收的衍生物肟，反應需要堿催化。

上述兩類反應正好互相補充，如有的化合物在酸性條件下不穩定，可用PNBA反應；反之若在堿性條件下不穩定，則可與DNPH反應。例如前列腺素和凝血噁烷先用重氮甲烷處理變成甲酯，再用PNBA反應生成對硝基芐基肟，在紫外254nm處有強吸收。

6、   金屬離子的柱后衍生反應

由于大多數無機金屬離子在紫外光譜區吸收弱，且無機離子與電解質緩沖液之間折射率的差異不很顯著，直接光度或示差折光檢測法很少用。雖然電化學檢測選擇性較高，但只適用于個別的無機離子。因此發展起來了柱后衍生-紫外吸收檢測法，該法特別適合于高價金屬離子-過渡金屬離子和鑭系金屬離子等的檢測。

最常用的金屬離子衍生試劑是4-（2-吡啶偶氮）間苯二酚（PAR），它能與34種金屬離子起反應。將1mmol的PAR溶解在pH值較高的緩沖溶液中（如NH2-NH4Ac），PAR可以與大多數過渡金屬離子（包括鑭系）形成絡合物，在520nm處檢測。

此外，還有其他一些金屬離子的檢測：4,5-二羥基-間苯二磺酸衍生測定鋁離子；1,5-二苯基碳酰肼衍生測定鉻（Ⅵ）離子；鋁酸鹽衍生測定硅酸鹽和磷酸鹽等。

實際案例—哌啶檢測

2,4-二硝基氟苯（2,4-EXJFB）作為衍生化試劑，對衍生化產物2,4-二硝基苯基哌啶進行定量測定[3]，反應方程式如下：

衍生條件：取限度濃度哌啶，加入催化劑NaHCO3約0.2g，渦旋1min，搖勻，室溫靜置反應1h后，15000r/min高速離心10min，取上清液即得。

該方法的靈敏度（檢測限，S/N，5-6）相當于供試品濃度0.0003%。

參考文獻

[1] 液相色譜檢測方法（第2版）—云自厚等編著

[2] 一種測定原料藥中哌啶殘留量的高靈敏度的方法。

[3] 黃柏林,頭孢噻肟鈉中殘留乙酸的測定方法研究[J].華章2010，（35）.

來源： 藥事縱橫