分享一篇發表在JACS上的文章，題目為"Expanding the Chemical Space of Antimicrobial Peptides via Enzymatic Prenylation"。通訊作者是日本靜岡大學的Daisuke Fujinami教授和Sohei Ito教授，課題組聚焦于酶催化修飾與抗菌肽功能調控研究。
在應對全球耐藥菌感染的挑戰中，抗菌肽（AMPs）因其獨特的膜靶向機制備受關注，但天然肽存在膜滲透性不足與穩定性缺陷。本研究創新性地利用異戊二烯化轉移酶PalQ對含色氨酸的抗菌肽進行精準修飾，通過引入分支狀異戊烯鏈增強膜相互作用。
作者首先從APD3數據庫篩選8種結構多樣的抗菌肽（包括Plantaricin A、Ci-MAM-A24等），經AlphaFold2預測顯示其涵蓋β-折疊、α-螺旋及無規卷曲構象。實驗發現PalQ可高效催化C端色氨酸異戊二烯化，其中Ci-MAM-A24的C5-二甲基烯丙基化率達100%，而難修飾肽段如TAT-Ras通過-1/-2位點甘氨酸取代使效率從0%提升至80%。這種甘氨酸依賴的增效機制源于其破壞C端二級結構，促進色氨酸深入酶活性中心——分子對接模擬顯示，肽段8557經雙甘氨酸取代（M10G/L11G）后形成延伸構象，與PalQ的Q197形成氫鍵錨定，質譜檢測到明確的+68 Da質量位移。
令人驚訝的是，當使用C10-香葉基供體時，Ci-MAM-A24-COOH（2b）意外發生雙位點修飾。HPLC分離出單修飾與雙修飾產物，質譜解析證實N端和C端色氨酸同時被香葉基化。為闡明N端修飾的化學本質，作者合成模型肽段WKRFH并通過NMR分析，發現香葉基連接于色氨酸Cδ2位，這是首次報道的Cδ2烷基化修飾類型。膜相互作用分析進一步顯示，香葉基化顯著增強脂質結合——添加 deuterated DPC后，香葉基周邊碳原子化學位移擾動>0.15 ppm，證實其直接參與膜錨定。
活性提升與膜作用強化直接相關。對大腸桿菌的抑制實驗表明，Ci-MAM-A24經C5/C10修飾后IC??從216.6 μM降至53.2 μM。更具突破性的是，Plantaricin A的C10-香葉基化使對乳酸桿菌活性提升18倍（IC?? 114.7→6.3 nM），分子動力學模擬揭示其色氨酸Cγ原子插入脂質雙層深度增加40%。這種膜擾動能力通過碘化丙啶滲透實驗驗證：香葉基化肽處理乳酸桿菌后，熒光強度隨濃度梯度上升，表明膜完整性破壞。值得注意的是，相較于傳統N-酰化修飾，C10-香葉基化PA-Win對大腸桿菌抑制活性提升15倍（105.0→7.2 μM），而相同鏈長的N-酰化僅提升5倍，凸顯異戊烯鏈的立體分支結構對膜靶向性的獨特優勢。
為克服PalQ應用瓶頸，作者通過PROSS平臺進行酶工程改造。針對陽離子抗菌肽與陰離子酶的靜電聚集問題，設計PalQ_PROSS突變體（23個位點替換）。該變體在1 M NaCl或50%乙腈中溶解度提升3倍，并在687 mM NaCl/34% DMSO體系中實現難溶肽8557的高效修飾。進一步對供體結合域改造，將I79/M82/Y85/F86突變為丙氨酸，成功將供體范圍拓展至C20-香葉基香葉基焦磷酸——質譜檢測到PalX肽段+272 Da質量位移，為抗菌肽疏水性精準調控提供新工具。
這項工作不僅證實異戊二烯化修飾可突破抗菌肽活性瓶頸，其開發的PalQ工程化平臺更適用于苛刻反應環境。獨特的Cδ2修飾機制為蛋白質定向脂質化開辟新途徑，未來通過底物結合域深度優化，有望實現復雜膜蛋白的功能重編程。
本文作者：TZS
責任編輯：WYQ
DOI：10.1021/jacs.5c06850
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c06850
