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Angew. Chem. Int. Ed. │N-酰基化酶助力全酶法合成唾液酸衍生物


殼多糖(chitin)是廣泛存在于自然界中的一種含氮多糖類生物高分子,主要來源于蝦、昆蟲等甲殼類動物的外殼和真菌類的細胞壁,蘊藏量占地球上所有天然高分子第二位。其降解成分葡萄糖胺(GlcNH2)是許多生物工程產品,如唾液酸衍生物的前體。

 

目前殼多糖主要是通過化學-酶法進行代謝 (Scheme 1)。首先殼多糖解聚得到乙酰葡萄糖胺(1),隨后酶解得到葡萄糖胺(2)。葡萄糖胺再經過N-酰基化、異構化、聚合等反應生成糖類生物工程產品。但是由于缺乏特異性的N-酰基化酶,從2轉變成3這一步只能依賴于化學手段,且反應條件苛刻,需要活化的有機酸、化學計量偶聯劑保護基團。對于自然界是否存在催化葡萄糖胺N-酰基反應的生物催化劑,仍有待確證。


Scheme 1.Current chemo-enzymatic cascades forthe conversion of chitin from biomass to complexglycoconjugates.

 

最近,南京農業大學糖組學和糖生物工程研究中心Josef Voglmeir教授(Fig. 1)課題組在Angew. Chem. Int. Ed.上發表最新研究成果,首次鑒定了能夠特異催化葡萄糖胺發生N-酰基化的蛋白CmCDA,該酶具有較好的底物寬泛性。這一發現打通了以殼多糖為起始,經過葡萄糖胺生物全酶法生產唾液酸苷衍生物的整條通路。Josef Voglmeir教授課題組長期致力于食品/營養糖組、糖生物學與工程、糖化學研究。


Figure 1.Professor Josef Voglmeir.

 

在沒有催化葡萄糖胺N-酰基化候選酶的情況下,研究人員從尋求已知生物催化劑的雜泛活性入手。該課題組曾報道一個殼多糖去乙酰化酶CmCDA,它能特異催化N-酰基葡萄糖胺發生去酰基化。研究人員推測保守氨基酸殘基His-His-Asp鋅結合三聯體穩定N-乙酰基,組氨酸和天冬氨酸分別作為廣義酸和堿催化形成四面體含氧陰離子,從而發生去乙酰化(Scheme 2)。依據此機制,研究人員假設CmCDA應該能夠催化去乙酰化的逆反應-N-酰基化。


Scheme 2. Proposed N-acylation mechanism of glucosamine by CmCDA.

 

于是研究人員將5當量的乙酸(3)、丙酸(4)、丁酸(5)、己酸(6)、疊碳乙酸(7)、羥基乙酸(8)、巰基乙酸(9)分別與CmCDA、葡萄糖胺(1)進行孵育(Table 1),果然能生成相應的N-酰基化合物210-15。同樣的反應條件,CmCDA卻不能接受苯甲酸作為羧酸供體,可能是酶對大基團芳香有機酸的空間和電子限制有關。反應需要過量羧酸是由于加入等當量的有機酸時,產率較低,而加入5當量則使反應平衡轉向酰胺鍵形成。


Table 1. CmCDA catalysed N-acylation of and transacylationof from carboxylic acids 3-9.

 

為了驗證在其他活性氨基基團存在下,CmCDA是否對葡萄糖胺仍具有選擇性。研究人員將γ-氨基丁酸(20)CmCDA、葡萄糖胺(1)進行孵育,LCMS檢測發現CmCDA能夠特異選擇催化葡萄糖胺,隨時間遞增生成21(Scheme 3)。考慮到CmCDA具有水解活性,能夠催化去乙酰化,研究人員假設CmCDA能否識別乙酰基葡萄糖胺發生N-轉酰基反應。眾所周知,酰胺鍵比較牢固,往往難以斷裂,通常N-轉酰基反應是以高氟酸酐作為羧酸供體在劇烈反應下實現的。為了驗證這一假設,研究人員將有機酸4, 5789在相同條件下與CmCDA、乙酰基葡萄糖胺(2)進行孵育,果然能生成相應的N-酰基葡萄糖胺10-1113-15,并伴有1的產生(Table 1)。這一結果說明CmCDA的轉酰基活性是由去乙酰化和酰基化兩步組成。

 

Scheme 3. LCMS analysis of CmCDA-catalysed N-acylation reaction of 1 and protection free 20shows the formation of 21



 

為了拓展該酶的用途,研究人員設計了“一鍋酶法”合成唾液酸苷衍生物的路線(Scheme 4)。首先葡萄糖胺(1)CmCDA作用下與羧酸供體7812反應生成相應的N-酰基葡萄糖胺,在異構酶作用下轉變成N-酰基甘露糖胺,然后酶催化與丙酮酸進行aldol加成生成“非天然”的唾液酸衍生物。最后與5--4--吲哚-β-D-半乳糖-吡喃糖苷(X-Gal,22)進行孵育,生成相應的唾液酸低聚糖苷23-25。這一過程只需五步酶催化就可以實現。

 

Scheme 4. One-pot five enzyme cascade for thesynthesis of sialosides 23-25fromglucosamine and X-gal (22).

 

綜上,研究人員首次發現了能特異催化葡萄糖胺發生N-酰基化的酶CmCDA,該酶能催化不經活化的有機酸與葡萄糖胺直接反應形成酰胺鍵,生成相應的酰基葡萄糖胺。利用該機制以葡萄糖胺為起始,“一釜五酶”法合成唾液酸衍生物。該工作豐富了N-酰基化酶工具箱,而生物酶法生產唾液酸苷及其衍生物,綠色環保,反應溫和、能耗低,為碳水化合物代謝工程應用奠定了基礎。


文章鏈接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201914338

整理:Wang, W

文章題目:

EnzymaticN-acylation Step Enables the Biocatalytic Synthesis of Unnatural Sialosides




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