甲醛是一種既可來源于環境也可內源產生的有毒化合物,在正常生理條件下能與DNA、蛋白質等發生反應,因此胞內存在多種途徑將甲醛轉化為其他物質。其中甲醛脫氫酶(FalDH)利用輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD,圖1)作為電子受體,將甲醛氧化成毒性較低的甲酸,同時得到還原型輔酶(NADH)。當甲醇進入細胞后,通過醇脫氫酶氧化為甲醛并產生NADH是一條重要轉化途徑。因此,當一分子甲醇分兩步氧化為甲酸,需消耗兩分子NAD,生成兩分子NADH。由于胞內NAD(H)關聯大量代謝反應及系列生物過程,不難想象細胞轉化甲醇和甲醛將影響NAD(H)穩態,產生難以預料的生物學效應。如果能讓這些脫氫酶利用非天然輔酶,就可能將甲醇和甲醛的氧化代謝在輔酶水平與內源代謝隔離,這對合成生物學和化學生物學研究具有重要意義。
圖1:甲醛脫氫酶催化的氧化反應(虛、實箭頭分別表示基于天然和非天然輔酶的體系) 在該研究中,作者成功改造惡臭假單胞菌來源的FalDH,使其利用一種非天然輔酶煙酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD,圖1)。首先,依據FalDH-NAD復合物的晶體結構,選擇與腺嘌呤部分距離在8 ?范圍內的氨基酸位點,構建FalDH突變體表達文庫,通過高通量篩選,發現L236V突變利用NAD活性顯著降低。基于序列分析和定點突變,發現A192K及A192R突變幾乎不識別NAD。繼續以A192K/L236V及A192R/L236V為模板,構建文庫和高通量篩選,最終得到多個偏好NCD的FalDH突變體,包括攜帶A192R/L223V/L236V三位點突變的FalDH*。催化反應動力學分析表明,FalDH*利用NCD比利用NAD的催化效率高150多倍。初步結構模擬分析表明,FalDH*中因R292的側鏈朝向輔酶結合口袋內部,有利于體積較小的NCD結合。 該工作獲得了有效使用非天然輔酶的FalDH*,對改造其他氧化還原酶也有參考價值。可喜的是,此前趙宗保研究團隊已獲得使用NCD的甲醇脫氫酶、甲酸脫氫酶、蘋果酸酶、乳酸脫氫酶等,創制了NCD合成酶,并構建出多種NCD-自給的工程菌株。將來可利用這些功能元件和菌株材料,創建基于非天然輔酶的代謝子系統,對胞內物質代謝和能量傳遞進行精準調控,為生物制造和生物能源產業提供先進技術。 論文信息 Engineering Formaldehyde Dehydrogenase from Pseudomonas putida to Favor Nicotinamide Cytosine Dinucleotide Junting Wang, Dr. Xiaojia Guo, Li Wan, Dr. Yuxue Liu, Haizhao Xue, Prof.?Dr. Zongbao K. Zhao ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.202100697







