監測細胞內生物分子的動態定位對于深入理解生命活動的時空調控機制具有重要意義。為實現對特定生物分子的可視化，研究人員已開發出多種化學和生物標記策略，廣泛應用于活體系統中。例如，通過基因工程或代謝工程手段，可將熒光或化學標記引入蛋白質、糖鏈等大分子中；而對于核苷酸、脂類等小分子，則通常采用體外合成帶有功能性標簽的類似物，再將其導入細胞或生物體內。標記后的分子通常通過熒光團修飾進行可視化，其方法包括免疫標記、金屬絡合、蛋白–配體識別、生物正交反應及酶催化反應等。

炔基標簽因其結構小巧、化學惰性和生物相容性，在活體成像中表現出極大的優勢。炔基可通過銅(I)催化的疊氮–炔烴環加成反應（CuAAC）與疊氮功能化探針進行高效、特異性的生物正交標記，該反應適用于細胞表面及體內環境。此外，炔基還具有獨特的拉曼光譜信號，可在無需熒光染料的情況下實現非侵入性和實時成像。

在此基礎上，作者提出了一個假設：若將炔基設計為光激活型，則可在特定區域經光照后選擇性激活其反應活性，從而實現分子標記的空間和時間調控，推動對分子動態過程的可視化研究。此前已有研究使用 DBCO 作為光敏炔基標簽，實現細胞表面分子的光控標記。DBCO 因其環辛炔結構產生的應變，可在無銅條件下與疊氮化物發生應變促發型環加成反應。然而其高反應性也導致在生理環境下易與細胞內的巰基（如谷胱甘肽）發生非特異性反應，限制了其在胞內的應用。

為克服上述限制，作者設計并合成了一種新型光激活炔基標簽分子，其核心在于通過引入光可降解保護基團穩定炔基中間體。在水溶液及生理條件下，該標簽可在 365?nm 紫外光照射下解籠，轉化為具有末端炔烴結構的活性分子（圖 1）。

圖 1：光激活線性炔烴標記的分子設計及其在細胞內的應用

圖 2a：籠狀炔烴前體 1 光轉化為相應炔烴 2 的反應；圖 2b：化合物 1 在有無光照下的核磁共振氫譜

作者測定了炔基前體化合物 1（0.1?mM）在不同光照強度（0–10?J^?cm?2）下的紫外–可見光（UV–Vis）吸收光譜。結果表明，隨著光照強度的增加，其在 350?nm 處的吸收逐漸減弱（圖 3）。該變化在 8?J^?cm?2 以上趨于飽和，此時的濃度較高，是為了確保能在吸收光譜中檢測到結構轉化。驗證了炔基前體 1 在水溶液中可在生物相容劑量的光照條件下轉化為炔類產物 2，實現了預期的光誘導結構激活。

圖 3：在 0 到 10?J?^cm?2 不同光照強度下，光籠炔烴前體 1 的吸收光譜

接著，帶有炔基標簽的膽固醇類似物 3（圖 4a）引入活細胞中，用于開展光誘導炔基標記實驗。將化合物 3 與 HeLa 細胞共孵育，隨后使用油酸處理細胞 1 天（油酸是脂滴的強誘導劑），以增強膽固醇類似物在脂滴上的富集與定位，便于在細胞中清晰地觀察其分布。油酸誘導后，對細胞進行光照，促使膽固醇類似物 3 在細胞內發生光轉化，生成末端炔烴化合物 4。完成光激活標記后，細胞被固定，并進行染色處理，以在顯微鏡下觀察炔基標記。

在熒光顯微圖像中，除了細胞核內部，整個細胞內均可清晰觀察到顆粒狀和纖維狀結構（圖 4e,f）。因此，推測熒光信號主要均勻分布于包裹細胞器和脂滴的脂質膜上。這種熒光分布圖像與孵育非籠化炔基膽固醇化合物 5 的陽性對照組細胞非常相似（圖 4c,d）。相反，在未接受光照的細胞中，孵育了光籠化炔基膽固醇化合物 3 后幾乎未觀察到熒光信號（圖 4g,h）。通過圖像分析對每個細胞中的熒光區域進行定量（圖 4k），結果顯示，光照與未光照組之間的熒光水平存在顯著差異。這些結果明確表明，大部分的光籠化炔基膽固醇 3 在光照后被成功轉化為末端炔類化合物 4。

圖 4：光誘導活細胞中炔烴標記的激活

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本文作者：WJ

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https://doi.org/10.1002/cbic.202500190