分享一篇發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章，文章標題是“Benchmark for Quantitative Global and Redox Proteomics Analysis by Combining Protein-Aggregation Capture and Data Independent Acquisition”，通訊作者是來自馬德里國家心血管研究中心的Jesús Vázquez教授和Ana Martinez-Val博士。Jesús Vázquez教授主要的研究方向是蛋白質(zhì)組學分析方法的開發(fā)。
蛋白質(zhì)中的Cys殘基能夠通過ROS或酶促反應(yīng)產(chǎn)生多種氧化修飾，包括二硫鍵，S-亞硝基化和S-磺酰化等，這些Cys上的氧化修飾通過調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、功能調(diào)控以及心血管和神經(jīng)疾病等病理過程中扮演著重要的角色。因此，全面、精確地分析蛋白質(zhì)組的巰基氧化還原狀態(tài)對于理解生命過程和疾病機制至關(guān)重要。
傳統(tǒng)的氧化還原蛋白質(zhì)組學（redox proteomics）技術(shù)依賴于差異烷基化策略：首先使用碘乙酰胺（IAM）封閉游離巰基（還原態(tài)），隨后使用還原劑將Cys的氧化修飾還原，再用另一種烷基化試劑（如MMTS）進行標記新產(chǎn)生的巰基（氧化態(tài)），實現(xiàn)對不同氧化狀態(tài)的Cys殘基的分析。然而，這類方法通常操作較為繁瑣，且由于Cys上同時帶有IAM和MMTS修飾，與依賴計算機預(yù)測譜圖庫的數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）模式不兼容，限制了該方法在大隊列臨床樣本中的應(yīng)用。作者希望能夠簡化制樣流程，并能夠使該方法與DIA相兼容。
作者開發(fā)出了被稱為PACREDOX 的集成化工作流程，相比于傳統(tǒng)氧化還原蛋白質(zhì)組學策略，該方法在樣品前處理和質(zhì)譜采集與數(shù)據(jù)分析兩方面均有了創(chuàng)新。在樣品前處理方面，作者使用Protein Aggregation Capture (PAC) 替代傳統(tǒng)的FASP，在高乙腈相中使用羥基磁珠捕獲所有的蛋白，并將Cys標記、氧化Cys還原和酶切全都在磁珠表面完成，顯著縮短了樣品制備時間，并能夠兼容自動化樣品制備流程。
為了能夠使該方法與DIA兼容，作者首先分析了PACREDOX的DDA數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示其中約有30%的MMTS修飾，與FASP制樣的結(jié)果一致；此外作者發(fā)現(xiàn)，對于序列相同的肽段， MMTS標記和IAM標記產(chǎn)生的二級譜中的碎片離子基本一致，而區(qū)別僅僅是保留時間更長。作者通過對實驗數(shù)據(jù)的擬合，給出了新的保留時間校正方程：，將此方程應(yīng)用于DIA-NN預(yù)測庫中MMTS肽段的保留時間，成功將MMTS肽段的鑒定比例從7%提升至預(yù)期的30%，與DDA結(jié)果一致。
最后作者使用豬心肌缺血/再灌注（I/R）損傷模型，比較了他們開發(fā)的PACREDOX+DIA工作流程與傳統(tǒng)的FASP+TMT標記工作流程，最后能夠得到完全相同的生物學結(jié)論，且相比TMT，DIA能夠鑒定到更多位點，且其中包括了Myomesin 2等潛在的重要蛋白。
總之，作者開發(fā)出了一種被稱為PACREDOX 的集成化工作流程，將高效的PAC樣品制備與DIA相結(jié)合，有望成為大規(guī)模樣本隊列中研究氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的強大工具。
本文作者：ZBY
責任編輯：TZS
DOI：10.1021/acs.analchem.5c03294
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c03294
