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Anal. Chem. | 定量全局和氧化還原蛋白質(zhì)組學分析

分享一篇發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章,文章標題是“Benchmark for Quantitative Global and Redox Proteomics Analysis by Combining Protein-Aggregation Capture and Data Independent Acquisition”,通訊作者是來自馬德里國家心血管研究中心的Jesús Vázquez教授和Ana Martinez-Val博士。Jesús Vázquez教授主要的研究方向是蛋白質(zhì)組學分析方法的開發(fā)。

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蛋白質(zhì)中的Cys殘基能夠通過ROS或酶促反應(yīng)產(chǎn)生多種氧化修飾,包括二硫鍵,S-亞硝基化和S-磺酰化等,這些Cys上的氧化修飾通過調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、功能調(diào)控以及心血管和神經(jīng)疾病等病理過程中扮演著重要的角色。因此,全面、精確地分析蛋白質(zhì)組的巰基氧化還原狀態(tài)對于理解生命過程和疾病機制至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的氧化還原蛋白質(zhì)組學(redox proteomics)技術(shù)依賴于差異烷基化策略:首先使用碘乙酰胺(IAM)封閉游離巰基(還原態(tài)),隨后使用還原劑將Cys的氧化修飾還原,再用另一種烷基化試劑(如MMTS)進行標記新產(chǎn)生的巰基(氧化態(tài)),實現(xiàn)對不同氧化狀態(tài)的Cys殘基的分析。然而,這類方法通常操作較為繁瑣,且由于Cys上同時帶有IAM和MMTS修飾,與依賴計算機預(yù)測譜圖庫的數(shù)據(jù)非依賴性采集(DIA)模式不兼容,限制了該方法在大隊列臨床樣本中的應(yīng)用。作者希望能夠簡化制樣流程,并能夠使該方法與DIA相兼容。

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作者開發(fā)出了被稱為PACREDOX 的集成化工作流程,相比于傳統(tǒng)氧化還原蛋白質(zhì)組學策略,該方法在樣品前處理和質(zhì)譜采集與數(shù)據(jù)分析兩方面均有了創(chuàng)新。在樣品前處理方面,作者使用Protein Aggregation Capture (PAC) 替代傳統(tǒng)的FASP,在高乙腈相中使用羥基磁珠捕獲所有的蛋白,并將Cys標記、氧化Cys還原和酶切全都在磁珠表面完成,顯著縮短了樣品制備時間,并能夠兼容自動化樣品制備流程。

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為了能夠使該方法與DIA兼容,作者首先分析了PACREDOX的DDA數(shù)據(jù),結(jié)果顯示其中約有30%的MMTS修飾,與FASP制樣的結(jié)果一致;此外作者發(fā)現(xiàn),對于序列相同的肽段, MMTS標記和IAM標記產(chǎn)生的二級譜中的碎片離子基本一致,而區(qū)別僅僅是保留時間更長。作者通過對實驗數(shù)據(jù)的擬合,給出了新的保留時間校正方程:,將此方程應(yīng)用于DIA-NN預(yù)測庫中MMTS肽段的保留時間,成功將MMTS肽段的鑒定比例從7%提升至預(yù)期的30%,與DDA結(jié)果一致。

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最后作者使用豬心肌缺血/再灌注(I/R)損傷模型,比較了他們開發(fā)的PACREDOX+DIA工作流程與傳統(tǒng)的FASP+TMT標記工作流程,最后能夠得到完全相同的生物學結(jié)論,且相比TMT,DIA能夠鑒定到更多位點,且其中包括了Myomesin 2等潛在的重要蛋白。

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總之,作者開發(fā)出了一種被稱為PACREDOX 的集成化工作流程,將高效的PAC樣品制備與DIA相結(jié)合,有望成為大規(guī)模樣本隊列中研究氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的強大工具。


本文作者:ZBY

責任編輯:TZS

DOI:10.1021/acs.analchem.5c03294

原文鏈接:https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c03294


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