基于疊氮-炔環加成反應的點擊化學，被廣泛應用于有機化學、藥物化學、化學生物學、分子生物學、細胞生物學等多學科領域。銅催化疊氮-炔點擊化學反應是一類高效的生物正交反應，但銅催化體系在生物體系中具有較差的生物相容性。環張力炔基如DBCO、BCN等可以在無銅催化的溫和條件下實現疊氮-炔基的環加成，極大地促進了點擊化學在活生物體系中的應用。
中科院上海藥物所黃蔚研究員和楊偉波研究員合作，發現環張力炔基DBCO結構可以在酸性條件下重排喪失其點擊化學反應活性。隨后，該團隊發現銀試劑AgNTf2或AgOAc可以在中性條件下促進DBCO快速重排生成四環產物。不同于酸催化，銀試劑催化DBCO結構重排不利于產生自身酰化四環產物，而且當反應體系有胺類化合物時，會發生轉酰胺反應，形成新的酰胺產物。在此過程中，銀試劑催化轉酰胺反應具有“籠縛”酰化試劑屬性：無催化劑條件下其酰化活性“束縛”在DBCO“籠狀”結構中，而在銀催化下從“籠”中釋放其酰化能力。在與疊氮基團的競爭反應中，銀試劑催化轉酰胺反應效率遠高于疊氮點擊化學反應，酰化產物產率高達95%。
圖1、DBCO的點擊化學反應性操控：（1）與疊氮的無銅催化環加成反應；（2）酸催化重排反應；（3）銀催化轉酰胺反應。
研究團隊選擇了不同的含有氨基的小分子化合物、多肽、糖肽、蛋白、糖蛋白等，對該反應進行了底物反應活性和選擇性的探索（圖2）。研究發現，銀催化條件下，DBCO可以快速的酰化氨基官能團；對三種包含20種天然氨基酸的多肽底物研究發現，DBCO酰化反應高選擇性地發生在Lys的氨基上，而不影響其他氨基酸。同時，銀催化DBCO酰化反應可以高效地修飾糖肽、BSA蛋白、糖蛋白RNase B 和IgG抗體等，表現出較好的底物適用性。此外，銀催化酰化反應可以實現Ph.D.12商業噬菌體庫的修飾且不影響噬菌體侵染活力，說明該方法具有應用于活生物體系中的潛力。
圖2、銀催化DBCO轉酰胺反應的底物適應性。DBCO結構包含Succinyl-DBCO、FITC-DBCO、Cy5-DBCO等；氨基底物包含氨基酸、多肽、糖肽、蛋白、糖蛋白和噬菌體。
進一步地，該團隊設計了一種DBCO標記的抗體Fc靶向肽，實現了抗體上特定Lys的定點酰化修飾（圖3）。利用靶向肽與抗體Fc的親和力，將其DBCO標記基團運輸到K249附近，在此過程中，DBCO的酰化活性處于“籠縛”狀態而不會與抗體發生隨機偶聯。然后，在銀催化下，DBCO重排，相應酰基選擇性地修飾Fc區域的K249，高效實現了抗體的定點偶聯，為定點抗體藥物偶聯物的設計提供了新的方法與思路。
圖3、DBCO標記的Fc靶向肽應用于曲妥珠單抗上K249的定點偶聯
綜上所述，銀催化下DBCO重排酰化反應，改變了DBCO的點擊化學反應性，從一個疊氮點擊反應試劑，轉變為高效、溫和、可控的“籠縛”酰化試劑，且具有很好的生物兼容性，可以應用于多肽、糖肽、蛋白、糖蛋白、噬菌體等多種生物活性底物。此外，DBCO標記的Fc結合肽可以選擇性地酰化抗體上的特定Lys，實現抗體的定點偶聯。該方法在化學生物學領域具有廣泛的應用前景，可以用于配體導向的靶蛋白定點修飾、配體-受體共價捕獲、相互作用蛋白-蛋白交聯等。
論文信息：
Manipulating the click reactivity of dibenzoazacyclooctynes: from an azide cliker to a caged acylation reagent
Shi, W.; Tang, F.; Ao, J.; Yu, Q.; Liu, J.; Tang, Y.; Jiang, B.; Ren, X.; Huang, H.; Yang, W.*; Huang, W.*
Angewandte Chemie International Edition
DOI: 10.1002/anie.202009408
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