色譜方法在藥物研發中占據重要地位，本文介紹了一些常用的色譜方法原理以及在藥物研發，尤其質量控制中應用的注意之處，并列舉了申報資料中色譜法應用的一些常見問題，以引起大家的關注。
色譜法是一種分離分析技術，通過將樣品中的組分分離，再逐個分析，因此是分析混合物、檢測化合物純度的有力手段，因而在藥物研發中廣為應用，包括原料藥、中間體、制劑和生物體液中化合物的定性和定量，涉及的待測物包括手性或非手性藥物、過程雜質、殘留溶媒、附加劑（如防腐劑）、分解產物、從容器和密閉包裝或制造過程中帶入的雜質、植物藥中的農藥和代謝物等，包括制備工藝研究、中間體控制、質控檢驗、穩定性及藥物動力學研究等過程。因此，色譜方法在藥物研發中占據舉足輕重的地位。
一、色譜法的幾種常見類型
1、HPLC法：
（1）手性液相色譜
將“手性識別”或“手性環境”引入色譜系統中，以形成暫時非對映異構體復合物，從而直接分離藥物對映體；或將對映體衍生化生成非對映體，而得以分離。即分離光學異構體可用手性固定相、衍生化后在非手性固定相上或在非手性固定相上用流動相手性添加劑形成非對映體來實現。
（2）離子交換色譜
使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽離子的分離；帶正電荷的交換基團（如季胺鹽）可以用于陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離。可用pH程序洗脫。
（3）離子對/親和色譜
常用反相離子對色譜，用緩沖液和加入的對離子（與被分離的樣品荷相反電荷）分離。分離受pH、離子強度、溫度、濃度和共存的有機溶劑類型的影響，親和色譜，一般用于大分子，使用配合體（共價結合在固體基質上的生物活性分子），與其同類的抗原（分析介質）反應，生成可逆轉的復合物，通過改變緩沖條件洗脫。
（4）正相色譜
將各種不同的有機官能團通過化學反應共價結合到固定相惰性載體上，固定相極性＞流動相極性。常用固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。適于分離水溶性的極性、強極性化合物，此時較小極性的組分比較大極性組分更快地洗脫。
（5） 反相色譜
將各種不同的有機官能團通過化學反應共價結合到固定相惰性載體上，固定相極性＜流動相極性。常用固定相：烷基、苯基等非極性有機分子，最常用ODS柱或C18柱，其極性很小，適于分離非機性、弱極性離子型樣品。是目前藥物研發中液相色譜的主要分離模式，通常用紫外檢測器，用水作基本溶劑，選擇性受溶劑強度、柱溫和pH的影響，一般來說較大極性比較小極性組分洗脫更快。
紫外檢測器可以用于各類液相色譜，這類檢測器要注意的是氘燈老化后的靈敏度降低，其靈敏度因儀器的設計和/或者制造廠家的不同而異。用紫外檢測器和反相HPLC組合得到的色譜圖不一定能真實的反映實際情況，原因是：①極性比目標化合物大得多的化合物可能被掩蓋（在溶劑前沿或死體積時同時洗脫）；極性比目標化合物小得多的化合物洗脫出來晚，甚至保留在柱上。為避免此情況發生，最好使用梯度洗脫法。②無紫外吸收或在檢測波長處吸收相差較大的多種化合物，有時在某一檢測波長處不能被檢出，因為通常只用一個檢測波長。為避免此情況發生，可改用其它類型檢測器，如示差折光檢測器；流動相許可時，最好使用蒸發光散射檢測器。
（6） 分子排阻色譜
以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯酰胺等）作固定相，依據樣品分子量大小達到分離目的。大分子不進入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進入大部分凝膠孔洞，在柱中被滯留，后被洗脫。
根據樣品性質可分為兩類：凝膠過濾（GFC）—用于分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖；凝膠滲透（GPC）—用于分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。SEC主要依據分子量大小進行分離，因此與樣品、流動相間的相互作用無關，因此不采用改變流動相的組成來改善分離度。
2、 氣相色譜（GC）
氣相色譜基于揮發性樣品由作為流動相的載氣運載，通過色譜柱內的固定相時發生吸附和解吸附過程進行分離。
通常GC分析的樣品是低分子量、易揮發、高溫穩定的化合物。藥物和藥物制劑中的殘留溶劑適于GC分析。常用的檢測器有用于含碳化合物的火焰離子化檢測器（FID），用于鹵化物的電子捕獲檢測器（ECD），用于含硫或磷化合物的火焰光度檢測器（FPD），以及用于含氮或磷化合物的氮磷檢測器（NPD）。填充柱已多被毛細管取代來改進分離度和分析時間，分析物位置與HPLC一樣，用保留時間（Rt）表示。
3、薄層色譜（TLC）
薄層色譜是一種最簡便普通的色譜技術，系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層，待點樣、展開后，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖作對比，用以進行藥品的鑒別、雜質檢查或含量測定（已少用）的方法。對于本身沒有顏色的化合物，檢出技術包括熒光、紫外和噴霧顯色劑。分析物在薄層板上的位置用Rf值（化合物的展開距離與溶劑前沿的比值）來表示。
三種方法中，薄層色譜最普通，因為薄層板上所有的組分都可用適宜的檢測技術檢出，但通常不如HPLC準確和靈敏。雖然選用適宜的檢測技術，TLC法能見到分析的“全圖”（whole picture）,但分析變異比HPLC大。
二、色譜法在藥物研發中的一般應用
TLC法主要用于藥物的定性鑒別，可從斑點的位置（Rf值）與顏色兩方面對藥物進行定性，優于HPLC和GC法（只能從色譜峰保留時間把握藥物的定性性質），定量時僅用于有關物質的限度檢測（半定量），結合不同原理的檢視技術，TLC法能見到分析的“全圖”（whole picture）,使各有關物質斑點均可顯示，但變異比HPLC法大；HPLC和GC法的主要優勢為定量，但如果運用得當，尤其在含量測定或有關物質項下已采用本法的情況下，利用對照品與供試品保留時間相同的特性作為鑒別依據，既不必專門實驗又增加了鑒別的專屬性，是非常可取的。由于分離分析的定量優勢，HPLC或GC法成為新藥研發不可缺少的手段，尤其生物樣品中藥物的定量，HPLC或GC法為最常用的分析手段。
1、定性鑒別
色譜法對同系物或具有相同母核藥物（尤其制劑）的鑒別具有光譜法和化學法無可比擬的優勢。但方法專屬性須經充分驗證，確保結構相近化合物或最難分離物質對在擬定色譜條件下能良好分離。申報資料所用鑒別法的色譜條件多數與有關物質、含量測定一致，實際上，在后兩者的方法學研究中，多以合成中間體、起始原料以及降解產物考察其專屬性，但在鑒別中，則以能夠與結構相似的同類藥物良好分離為主要考慮，故在專屬性驗證中宜得到體現。
但在實際操作中有時遇到同一物質在完全相同的色譜系統中保留時間不一致的情況，藥典中對保留時間（斑點位置）的一致性未予具體規定。對此，可采用如下措施：（1） 注意色譜系統的穩定性，流動相（展開劑）與固定相相匹配，在C18柱的反相色譜系統中，流動相有機溶劑比例不低于5％，避免C18鏈的隨機卷曲將造成色譜系統不穩定導致組份保留值波動的現象；TLC的色譜展開要適中，使主斑點的Rf值在0.2～0.7間。（2） 操作中另配制一供試品與對照品等量混合的溶液，進樣（點樣）后出現單一色譜峰（斑點）作為鑒別依據，以彌補該法之不足。
2、有關物質檢查
2.1 TLC法因設備和操作簡便、檢視（顯斑）方法多而較常用，但由于其變異性大，應充分驗證系統的適用性，使各斑點Rf值在0.2－0.7之間，并應分離清晰。新版歐洲藥典提出了斑點分離度計算公式：Rs=1.18α(RF2-RF1)/ωh1+ωh2(Rs:分離度，α：溶劑前沿，RF2、RF1：比移值，ωh1、ωh2：斑點寬)，可積累經驗予以采納。雜質檢測可用對照品比較法或自身對照法，前者用于已知雜質控制并需雜質對照品，也可兩種方法結合應用，自身對照法應注意雜質斑點與主成分斑點色調應一致，具有可比性，必要時可選用熒光薄層板，利用熒光熄滅法檢視，或兩種檢視方法結合應用。結果的判斷，除控制雜質的斑點數與限度外，也可采用兩種以上不同濃度的對照溶液分別比較。如某藥品，用自身稀釋成1.5%和0.5%兩種濃度的對照液，供試液如顯雜質斑點，不得多于3個，允許1個超過0.5%，但不得過1.5%，其余雜質斑點均不得過0.5%作限量要求。
在TLC法的方法學研究中，可配制多個展開劑系統及不同的吸附劑，進行幾種組合的試驗，將主成分與已知的中間體、副產物、降解物或異構體斑點的顏色及分離情況進行對比，確定最佳色譜系統。同時要采用適宜的稀溶液驗證其靈敏度，確定合適的檢視方法，處理好靈敏度與雜質限度的關系。并通過適當改變展開劑比例及pH值，考察檢測方法的耐用性。由于影響TLC法重現性因素較多，如薄層板質量、點樣技術、展開室溫濕度等都可能影響色譜分離度或靈敏度，需在質量標準中對分離度和靈敏度做出明確要求，如：實驗時，除供試液、對照液點樣外，主藥與另一結構相近化合物（最難分離物質對）混合溶液，以及另一低于標準限度的對照溶液同時點樣，要求混合溶液應顯示分離良好的斑點，后者應顯示清晰斑點，以確保檢測結果的可靠性。
2.2 根據藥物的理化性質，HPLC法首選C18柱；流動相首選甲醇－水系統，必要時加入某種溶劑如乙腈或少量酸堿溶液、緩沖液等，以硅膠為載體的鍵合固定相填充劑適用pH2～8的流動相，pH大于8時，可使載體硅膠溶解，此時應選用包覆聚合物填充劑、高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、非硅膠填充劑或有機－無機雜化填充劑等耐堿填充劑；pH小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落，此時應選用有機－無機雜化填充劑、具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或而異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠等耐酸填充劑；如分離不好可選用其它類型柱和流動相，對某些品種需用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求時，可注明適用的牌號；檢測器首選UV檢測器，流動相合適時，蒸發光散射檢測器可能更好，可積極研究，成熟時予以采用。
采用的定量方法有：
（1）雜質對照品法，即外標法。僅限于對已知雜質的控制，如采用該法，則應注意對該對照品進行定性研究，并制訂其質量要求。
（2）加校正因子的主成分自身對照法，即以主成分作對照的內標法，校正因子可在檢測時測定，但需提供雜質對照品，也可在建立方法時將測得的校正因子載入質量標準，供以后常規檢驗使用，無需長期提供雜質對照品，但也僅適于已知雜質的控制。
（3）不加校正因子的主成分自身對照法，實質上也是以主成分作對照的內標法，但其前提是假定雜質與主成分的響應因子相同，適用于具有與主成分相同或類似發色團的雜質，因一般情況下，有關物質與主成分具有相似的分子結構，此法不致發生太大誤差。
（4）峰面積歸一法，簡便快捷，但因各雜質響應因子不一定相同、雜質量與主成分量不一定在同一線性范圍、儀器對微量雜質和常量主成分的積分精度及準確度不同等因素，可產生較大的誤差。
一般情況下，校正因子在0.9～1.1時可不予校正，即3法，校正因子在0.5～5.0以外時，應改變檢測波長使在該范圍內，如無法調節，應采用（1）法；由于有關物質中有已知的亦有未知的雜質，故采用（1）＋（3）法或（2）＋（3）法比較理想，同時控制產品中的已知雜質和未知雜質；使用（3）法時，應在考察已知有關物質的校正因子（應位于0.5～5.0以內）或結合二極管陣列檢測結果（主成分與各有關物質的UV吸收偏差應不大）后采用，也可根據物料平衡原理（含量測定值與有關物質值的和與供試品理論總量的偏差）驗證方法是否可行；一般不主張在質量標準中采用（4）法，但在對映體雜質的檢測中是一個簡捷的方法，也可用于穩定性研究中對雜質變化的監測。
3、含量測定：色譜法按外標法或內標法以峰高或峰面積進行定量。
內標法用于GC和HPLC減小測定誤差，曾經起到很好的作用，特別是在GC中，進樣量小，內標法能顯著提高定量精度，隨著現代分析儀器的發展，原手動進樣已被定量環或自動化程度高的進樣器所取代，內標法的應用受到挑戰，尤其在HPLC中，由于進樣量大，外標法已具有很好的進樣精度，加入內標，有時反而對分析不利，有研究者曾隨機選取藥典中八個內標法測定含量的藥品進行試驗，結果表明，內標法均不能提高分析精度，實際上，內標法使分析誤差與經常校準的外標法相比增加了√2倍，說明測定兩個峰比測定一個峰引入的誤差要大。一般情況下，如下情況適合于使用內標法：復雜的樣品制備過程，如多次提取；低濃度的樣品（靈敏度是確定的），如藥代動力學的研究；在樣品分析中預計是很寬的濃度范圍，如藥代動力學研究。外標法多用于原料驗收、成品質控、穩定性和TLC法，內標法多生物體液和GC法。需要注意的是，在外標法中，保持供試品濃度與對照品濃度相近可以改善方法的準確性。
峰高定量僅在峰高隨樣品量呈線性變化時使用，當峰形不正或色譜柱超載時，峰高法會出現較大誤差，由于峰高測量受相鄰重疊峰的干擾較小，故比峰面積定量更為準確，如BP中慶大霉素C組份檢測明確要求峰高定量。峰面積定量的好處是其精度受儀器參數變化的影響較小，對不是高斯分布的峰形也能較好定量，但其準確度受相鄰峰重疊的影響。一般情況下，為得到較好的精確度，宜用峰面積定量；為最大限度地排除其它組份的干擾，則多用峰高定量。痕量分析中多用峰高法定量。
三、申報資料中幾種常見問題
1、方法靈敏度不夠－－定量限高于雜質限度
例1.有關物質檢查法的定量限為0.75ng，標準規定雜質限度不得過1.0%，折算為0.5ng，表明此法不能有效檢測產品雜質，需重新建立有效的雜質檢測方法。
2、檢測方法缺乏互補性
例2.某藥品有關物質研究中顯示，合成中重要中間體N－環己基－5－（4－氯丁基）－1，2，3，4－四氮唑在檢測波長處無吸收，故建立的有關物質檢查方法無法檢測該物質。需建立該中間體適宜的檢測方法，考察其在產品中的殘留情況，視情況訂入質量標準。
例3.提供的有關物質檢查方法不能檢測中間體，請制訂合適的中間體檢測方法（如TLC法等），并提供方法學研究資料，考察其在產品中的殘留情況，視情況訂入質量標準。
3、強制降解忽視藥物的敏感條件
例4.對乙酰氨基酚水解后極易受到氧化破壞，需補充考察本品氧化破壞后主成分與降解物的分離情況，以驗證有關物質檢測方法的可行性。
4、強制降解條件過于劇烈，無法判斷主峰與降解產物的分離情況
例5.樣品經堿解、氧化破壞后，主藥頭孢特侖匹酯被完全破壞，無法說明其降解物與主峰的分離情況，需調整降解條件的劇烈程度，考察主峰與降解產物的分離情況。
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