黃精為百合科黃精屬植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.、黃精P. sibiricumRed. 或多花黃精P. cyrtonema Hua的干燥根莖。具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎的功效^[1]。黃精主要成分有多糖、甾體皂苷、蒽醌、黃酮及氨基酸類等。以其炮制品酒黃精用于臨床，通過炮制以消除其麻味，減輕對咽喉的刺激，并增強補脾潤肺、益腎作用^[2]。黃精采用蒸法炮制，藥材本身含有大量的糖類和氨基酸類成分，筆者在前期研究中，在酒黃精薄層色譜中檢識到Maillard反應標志性產物5-羥甲基糠醛^[3]，提示黃精炮制過程可能發生Maillard反應。

Maillard反應是指氨基化合物和羰基化合物之間發生的非酶促反應^[4]，反應過程非常復雜，會產生不同結構的小分子和大分子的Maillard反應產物（MRPs）^[5]。反應伴隨物理化學特征如顏色變化^[6]和pH值降低^[7]。反應體系顏色的變化常采用UV-vis法分析，通過280 nm吸光度值表征產物特征^[8-9]。隨著MRPs的生成反應體系酸度降低，因此pH檢測也是確定Maillard反應發生的重要指標。GC-MS法是最常用的分析MRPs小分子化合物的方法^[10]。研究表明，MRPs具有抗氧化活性，通常使用比色法檢測MRPs對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除率，以表征其抗氧化活性^[11]。

目前《中國藥典》2015年版中黃精和酒黃精均采用苯酚硫酸法測定多糖含量作為質量控制指標，特異性不足。同時，黃精炮制缺乏規范性，全國各地黃精炮制時間不等^[12-14]。本實驗從黃精酒炙過程中Maillard反應物理化學特征、小分子MRPs以及抗氧化活性角度，確定黃精酒炙發生Maillard反應，并對反應產物和抗氧化活性隨炮制過程的變化進行分析，尋找黃精與酒黃精差異性成分，以期為黃精與酒黃精質量評價方法和炮制規范提供基礎。

1  儀器與材料

Agilent 8453紫外可見分光光度計，美國Agilent公司；GC-MS-QP2010型氣相-質譜聯用儀，日本島津公司；Rxi-5ms石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國Restek公司；3520型便攜式酸度計，英國Jenway公司；FW-80微型高速萬能試樣粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；TCQ-250超聲波清洗器，北京醫療設備二廠；CP225D電子天平，220 g/0.01 mg，德國Sartorius公司；超純水系統，美國Thermo Scientific公司。

C₈～C₂₀正構烷烴混合標準品購自美國Sigma公司，批號1443129；氦氣購自北京兆格氣體科技有限公司；二氯甲烷，分析純。紹興黃酒，瓜渚湖黃酒，紹興縣第三酒廠，2010.11.20生產；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美國Sigma公司；還原型谷胱甘肽（批號140706-200702，質量分數為98.9%）對照品為含量測定用，購自中國食品藥品檢定研究院；其他試劑均為分析純。3個品種的黃精鮮品均采自貴州省黔西南布依族苗族自治州興仁縣，經北京中醫藥大學中藥學院劉春生教授鑒定，分別為百合科植物滇黃精Polygonatum kingiaum Coll. et Hemsl.、黃精P. sibiricumRed. 和多花黃精P. cyrtonemaHua的根莖，曬干。

2  方法與結果

2.1  炮制品制備^[1]

黃精除去雜質，洗凈，略潤，切厚片（2～4 mm），烘箱50 ℃吹風干燥，即得。

酒黃精為取上述黃精飲片，加黃酒（100 kg黃精用黃酒20 kg），拌勻，悶潤過夜至酒吸盡，置適宜容器內，隔水加熱，分別燉至不同時間取出，干燥，即得。

2.2  供試品溶液的制備

取各供試品粉末（過60目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入二氯甲烷100 mL，稱定質量，30 ℃以下超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用二氯甲烷補足減失的質量，搖勻，濾過，得到二氯甲烷組分。根據各項分析需要，適當稀釋或濃縮。

2.3  紫外-可見光吸光度測定

2.3.1  黃精吸光度隨炮制不同時間的變化  以多花黃精為研究對象，對不同炮制時間黃精二氯甲烷組分的紫外吸收光譜變化進行研究。取供試品溶液，以溶劑為空白，在紫外區200～400 nm掃描，最大吸收波長280 nm處測吸光度（A₂₈₀）值結果見表1。結果顯示，多花黃精二氯甲烷組分A₂₈₀隨炮制時間的延長而增加。

2.3.2  不同品種黃精A值變化  全國各地黃精炮制時間為12～24 h^[12-14]，因此對《中國藥典》2015年版收載3個品種滇黃精、黃精及多花黃精炮制相同時間（16 h），得到不同品種酒黃精，測定二氯甲烷組分A₂₈₀，結果見表2。結果顯示，《中國藥典》2015年版收載的3個品種黃精經炮制16 h后，A₂₈₀都增加，顯示Maillard反應特征，但各品種增加的幅度不同。來源于滇黃精、黃精和多花黃精的黃精，炮制16 h得到的酒黃精A₂₈₀分別是生品的1.6、15.7、2.7倍。顯示各品種黃精存在一定的成分差異。

2.4  pH值變化

2.4.1  黃精炮制不同時間二氯甲烷組分pH值變化  采用酸度計測定不同炮制時間多花黃精二氯甲烷組分pH值，精確至±0.01，結果見圖1。隨著炮制時間的延長，多花黃精二氯甲烷組分pH值呈降低的趨勢，由生品的4.66，降至16 h時最低的3.43，隨后變化緩慢。

2.4.2  不同品種黃精炮制相同時間后二氯甲烷組分pH值變化  以來源于滇黃精、黃精及多花黃精的樣品為研究對象，對這3個品種黃精炮制相同時間（16h）酒黃精二氯甲烷組分的pH值變化進行了研究。表3顯示，3個品種黃精炮制16 h得到的酒黃精，二氯甲烷組分pH值與生品比較都呈現酸性變化趨勢。但各品種變化程度不同，多花黃精變化幅度最大，顯示品種之間存在成分差異。

2.5  GC-MS法分析黃精小分子MRPs

2.5.1  GC-MS色譜條件

（1）氣相色譜條件：Restek Rxi-5ms石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度為220 ℃；程序升溫：起始溫度為41 ℃，以10 ℃/min升至160 ℃，保留1 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保留2 min，再以8 ℃/min升至300 ℃，再保留8 min；進樣量為4 μL，分流比為1∶20，載氣為氦氣。

（2）質譜條件：電離方式為EI，離子源溫度200 ℃，接口溫度為220 ℃，電子能量70 eV，電離電壓1 760 V，質量掃描范圍m/z45～550。按上述氣相及質譜條件對供試品分析，得其總離子流圖，見圖2。

2.5.2  GC-MS分析 對總離子流圖中的各峰經質譜掃描后得到各組分的質譜圖，經過質譜計算機數據檢索系統（質譜數據庫NIST05.LIB、NIST05s. LIB、NIST08.LIB、NIST08s.LIB和Wiley9.LIB）僅計算匹配度大于80%的鑒定結果，同時參考C₈～C₂₀正構烷烴混合標準品在此實驗條件下的保留指數（retentionindex，RI）^[15]，用峰面積歸一化法計算樣品中各組分的相對質量分數，從而確定黃精和不同炮制時間酒黃精中的化學成分以及各化學成分相對質量分數。從黃精與4、8、16、24、32 h酒黃精中，分別鑒定出15、17、18、18、25、22個化合物。這些化合物為雜環類、酸類、酯類、烷烴類、醇類、酮類和烯烴類等。黃精與不同炮制時間酒黃精共同含有12個化合物。5個不同炮制時間酒黃精共新產生了15個化合物（表4），其中4、8、16、24、32 h酒黃精分別有5、6、6、13、10個。依據成分含量隨炮制時間的變化趨勢可分為3類：第1類成分隨著炮制時間的延長含量呈現增加趨勢的化合物有4個，包括正己酸、3-羥基二氫-2(3H)-呋喃酮、4-羥基二氫-2(3H)-呋喃酮和5-羥甲基糠醛；第2類成分先升高后下降的化合物為3,5-二羥基-6-甲基-2,3-二氫-4H-吡喃-4-酮、4-甲基-2,6-二叔丁基苯酚和2-乙基己基草酸己酯；第3類成分呈現起伏變化，為乙基鄰苯二甲酸酯、乙基亞油酸酯和2-乙基己基草酸己酯。

2.6  黃精炮制前后二氯甲烷組分的抗氧化活性變化

參考文獻方法^[16]，采用無水乙醇配制DPPH 0.1 mmol/L溶液，避光保存。取適量供試品溶液2 mL加入具塞試管中，加入DPPH溶液2 mL，搖勻，密閉放置30 min后，以80%乙醇溶液為空白，在517 nm處測定其吸光度（A₂）；取供試品溶液2 mL加入具塞試管中，加入80%乙醇溶液2 mL，搖勻，密閉放置30 min后，測定其吸光度（A₀）；取80%乙醇溶液2 mL加入具塞試管中，加入DPPH溶液2 mL，搖勻，密閉放置30 min后，測定其吸光度（A₁）；按照清除率＝1－(A₂－A₀)/A₁計算清除率，清除率越大，抗氧化能力越強。

相同生藥質量濃度（40 mg/mL）的多花黃精及不同炮制時間的酒黃精DPPH自由基清除率結果（圖3）顯示，隨著炮制時間的延長，二氯甲烷組分DPPH自由基清除率呈遞增趨勢，黃精清除率為33.31%，炮制至16 h達到最高為67.21%，隨后炮制24 h和32 h趨于穩定。

不同質量濃度的多花黃精及其16 h酒黃精的二氯甲烷組分DPPH自由基清除率結果（表5）顯示，酒黃精二氯甲烷組分DPPH清除率隨生藥量的增加而增加；黃精DPPH半數抑制濃度（IC₅₀）值為64.24 mg/mL，酒蒸16 h后的為23.41 mg/mL。IC₅₀值越低，抗氧化能力越強，可見酒黃精的抗氧化能力強于黃精。

相同生藥質量濃度（40 mg/mL）的不同品種黃精炮制16 h后酒黃精，DPPH自由基清除率變化（表6）顯示，經炮制后，滇黃精DPPH自由基清除率從18.89%增加至49.20%（P＜0.05），黃精從36.89%增加至68.58%（P＜0.05），多花黃精從33.21%增加至66.16%（P＜0.05），3個品種黃精的二氯甲烷組分DPPH自由基清除率均明顯增加。

3  討論

3.1  Maillard反應物理化學特征分析

Maillard反應中間產物的紫外特征吸收波長是280 nm或294 nm^[8,17]。根據全波長掃描結果，選取最大吸收波長280 nm作為黃精及酒黃精的檢測波長。黃精及酒黃精的二氯甲烷組分在280 nm波長下的紫外吸光結果顯示，黃精經炮制后A₂₈₀增加，且隨炮制時間的延長，A₂₈₀呈遞增的趨勢。表明黃精炮制過程中Maillard反應中間產物增加。滇黃精、黃精和多花黃精3個品種黃精炮制相同時間A₂₈₀分別是生品的1.6、15.7、2.7倍，顯示不同變化程度，可能與3個品種黃精的化學成分差異有關，因為MRPs與反應底物糖及氨基酸、反應條件等密切相關^[18]。

有研究以DPPH自由基清除率為指標，考察黃精中含量最高的氨基酸纈氨酸與葡萄糖/果糖發生Maillard反應時時間、溫度、初始pH值和氨基與羰基物質的量比的影響，結果纈氨酸與2種單糖呈現了不同的最佳反應條件^[19]。同時，黃精炮制后280 nm波長紫外A值的變化除了與MRPs有關，也可能與黃精中其他成分在炮制過程中的變化相關，還需要深入研究確定。

體系酸度降低是Maillard反應的特征^[20]。黃精炮制過程中二氯甲烷組分的pH值測定結果顯示，黃精炮制后pH值降低，且隨著炮制時間的延長而呈遞減趨勢。Maillard反應過程中pH值降低，是由于氨基酸的堿性基團-氨基在加熱過程中不斷地與還原糖的羰基進行縮合，使得游離的氨基被封閉，致使體系的pH值不斷下降^[21]。當達到偏酸環境時，pH值下降速度減緩，因為中間階段產生了緩沖液，包括有機酸、乙酰丙酸、丙酮酸等^[22]。因此，推測黃精在炮制16 h后Maillard反應速率降低。

3.2  炮制后MRPs分析

二氯甲烷是最常用的提取小分子MRPs的溶劑。Maillard反應很復雜，可產生不同種類的MRPs，起始階段形成Amadori化合物^[23]，中間階段產生呋喃類、吡喃類、糠醛類、吡咯類、吡啶類等化合物^[24]，終產物是蛋白黑素類^[23]。分析顯示，黃精炮制既有新的成分產生，也有之前存在成分的消失，同時，各成分比例也發生了變化。具有MRPs特征的成分有3-羥基二氫-2(3H)-呋喃酮、4-羥基二氫-2(3H)-呋喃酮、5-羥甲基糠醛、3,5-二羥基-6-甲基-2,3-二氫- 4H-吡喃-4-酮。后2個成分是Maillard反應標志性成分^[25]，在何首烏炮制品制何首烏中也檢測到這2個成分^[26]。5-羥甲基糠醛是16、24、32 h酒黃精中占比最高的成分。反應產物在黃精及酒黃精質量評價的應用，還需深入研究。

3.3  炮制后抗氧化活性變化

研究表明大多數MRPs都具有抗氧化活性^[27]，而檢測DPPH自由基的清除情況，可以評價樣品的抗氧化活性，清除率越大，抗氧化活性越強。結果顯示，隨著炮制時間的延長，多花黃精二氯甲烷組分DPPH自由基清除率呈遞增趨勢，至16h達到最高然后趨于平穩。

多花黃精及其16 h酒黃精的二氯甲烷組分DPPHIC₅₀比較顯示，黃精炮制后IC₅₀值降低，抗氧化活性增強；3個品種黃精經炮制后，其二氯甲烷組分的DPPH自由基清除率明顯增強。Maillard反應中產生的一些小分子揮發性物質具有抗氧化活性，Eiserich等^[28]發現二氯甲烷提取的半胱氨酸與葡萄糖的MRPs中，有3種物質都擁有抗氧化活性，主要是噻唑類和呋喃酮類化合物。Maillard反應產生的一些揮發性產物，比如吡咯和吡嗪等都表現出了較好的抗氧化活性^[29-30]。

綜上，研究結果提示黃精在炮制過程中發生了Maillard反應，使得酒黃精中含有特征性的MRPs 2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羥甲基糠醛等。隨著炮制時間的延長，酒黃精抗氧化活性增強，至16 h達到最高隨后趨于穩定。研究為黃精與酒黃精質量控制與炮制工藝規范化提供參考。

參考文獻（略） 

來  源：王  淳，宋志前，寧張弛，梁東蕊，馬新玲，萬曉瑩，劉振麗. 黃精炮制二氯甲烷組分Maillard反應產物及抗氧化活性研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(3):604-610.

來源：中藥雜志社