分享一篇近期發表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文獻，題為：Dual Self-Promoted Ring-Opening Polymerization towards Cationic Polypeptoids with Stable Helices，該工作的通訊作者是來自蘇州大學的張正彪教授。

    陽離子螺旋是普遍存在于多種生物體中的結構基序，在膜相互作用、蛋白質運輸和免疫防御等生物過程中發揮重要作用。天然陽離子螺旋主要采用α-螺旋結構，含有賴氨酸和精氨酸等帶電殘基。然而，將帶電殘基引入多肽通常會破壞α-螺旋的穩定性，因為側鏈靜電排斥會破壞維持螺旋結構所必需的氫鍵。螺旋穩定性通常隨帶電殘基數量增加以及陽離子基團與主鏈之間距離的減小而降低。例如，帶正電荷的聚（L-賴氨酸）呈現無規卷曲構象（圖1a），但在細胞穿透、基因傳遞和抗菌等應用中，螺旋結構通常比無規卷曲更具優勢。

    為穩定陽離子多肽的α-螺旋結構，研究引入了長帶電側鏈，使帶電部分遠離主鏈（圖1b），從而顯著降低螺旋表面的電荷密度，避免電荷排斥破壞螺旋結構。此外，側鏈的疏水性也至關重要：只有當側鏈足夠長且疏水，且電荷距離主鏈11個σ鍵時，才能顯著穩定α-螺旋。然而，疏水性的增強與正電荷結合會顯著增加細胞毒性。

    聚類肽作為多肽的結構類似物，其取代基從α-碳原子轉移到氮原子上，這一變化消除了主鏈的手性中心和氫鍵供體，阻止了多肽中常見的強氫鍵相互作用。此外，與多肽中酰胺主要呈反式構象不同，聚類肽的三級酰胺因順/反構象能量接近而易發生構象轉換。缺乏分子內氫鍵以及順/反異構化的存在，導致聚類肽主鏈具有固有的靈活性，難以折疊成螺旋等剛性二級結構。已有報道的策略旨在控制聚類肽的順/反酰胺異構化，以使其主鏈剛性化（圖1c）。一種常見的方法是通過使用極大體積的α-支鏈側鏈來誘導順式酰胺構象以最小化了與反式構象相關的空間相互作用。不同于通過N-H-O分子內氫鍵和側鏈疏水相互作用穩定的α-螺旋，類肽中觀察到的這些類PPI螺旋構象主要由側鏈的空間位阻穩定。另一種方法涉及引入陽離子側鏈，如三唑鎓、烷基吡啶鎓、和季銨側鏈，通過主鏈羰基與帶電側鏈部分之間的靜電和氫鍵相互作用來誘導順式酰胺構象，然而，這些陽離子肽不能形成螺旋結構。

    在本篇工作中，作者通過可控開環聚合高效合成了帶有大體積、手性叔胺側鏈的聚類肽（圖1d），聚合不僅存在側鏈介導的質子轉移和螺旋誘導加速的雙重自促進機制，還形成了與聚脯氨酸類似的類PPI螺旋，不同的是，該聚類肽具有良好的水溶性。

圖1. a) 由于帶電側鏈的靜電排斥破壞了α-螺旋穩定性所必需的氫鍵，L-PLys 采用無規卷曲結構。b) 通過延長側鏈以降低表面電荷密度并增強側鏈間的疏水相互作用來穩定多肽的α-螺旋。c) 通過使用特殊側鏈促進順式酰胺構象來剛性化聚肽主鏈。d) 通過雙自促進ROP高效合成陽離子類PPI螺旋聚類肽。該類PPI螺旋聚類肽通過空間約束以及側鏈與主鏈之間的 C-H···O氫鍵被陽離子側鏈穩定。

    首先作者合成了帶有手性叔胺側鏈的N-取代N-羧酸酐（NNCA）單體，原位生成的HCl質子化了叔胺側鏈，形成叔胺鹽酸鹽單體，可以從反應混合物中沉淀出來。

    隨后在氯仿中實現了單體的聚合（圖2a），加入等摩爾三乙胺去質子化以增加溶解度，反應呈現為活性聚合，通過調節初始單體與引發劑濃度比（[M]₀:[I]₀）可以很好地控制聚合物的分子量（M_n）（圖2b），在聚合過程中，M_n隨單體轉化率呈線性增加，而分子量分布保持較窄（D <1.2）（圖2c），單體加入后成功的鏈延伸進一步支持了聚合的活性特征（圖2d），聚合物的 MALDI-Tof-MS 譜圖顯示聚合物具有良好的端基保真度。盡管存在顯著的空間位阻，作者觀察到了單體能夠非常迅速的聚合。

圖2. a) ROP 合成方案及單體化學結構。b) 不同DP下L-P1的SEC曲線。c) L-M1的 ROP 過程中M_n和D隨單體轉化率變化的曲線（[M]₀:[I]₀:[TEA]₀= 50:1:50）。d) 鏈延伸前后L-P1 的 SEC 色譜圖。e) L-P1 (DP=25) 的 MALDI-Tof-MS 譜圖。

    為了探究聚合機制，作者對一系列結構相關的單體進行動力學研究，通過使用DFT計算方法優化了這些單體的空間填充圖，還獲得了相應仲氨基增長鏈末端的空間填充圖，使用埋藏體積（%Vbur）來表示單體在氮原子周圍的立體環境，L-M1 顯示出最高的空間位阻，%Vbur為36.1%（圖3a），但出乎意料地表現出最快的聚合動力學，所得 L-P1的CD 光譜在 210 nm 附近顯示最大正吸收帶，在195nm和225nm 之間有兩個負吸收帶，表明其具有類PPI螺旋結構。相比之下，盡管存在手性叔胺側鏈，所得的L-P2、L-P3和L-P4采用了更無序的結構（圖3f），因此，L-M1的快速聚合可能是由于所得聚合物鏈的剛性螺旋結構，增強了增長鏈末端與單體相互作用的可及性。

    同時對映體L-M1和D-M1表現出相當的聚合速率，比外消旋單體聚合更快（圖3b），相應的對映體的均聚物CD光譜也呈鏡像，而外消旋對應物無CD信號，為了研究叔胺側基的作用，作者嘗試了L-M6和L-M7的聚合，二者具有與L-M1相似的位阻，所得的聚合物也采用類PPI螺旋結構（圖3a,g），但聚合速率顯著更慢。L-M1和M5之間聚合速率的差異也能說明，具有環己基側鏈的非手性M5比在鄰位含有一個額外叔胺基團、空間位阻更大的L-M1要慢得多（圖3d）。這些動力學研究表明了L-M聚合的雙自促進機制：聚合物鏈的剛性螺旋主鏈促進和側鏈上的叔胺基團促進。

圖3. a) 通過 DFT 計算方法（BP86）優化的L-M1到L-M7的空間填充圖。b) L-M1、D-M1和L-M1 + D-M1的動力學研究圖。c) L-M1、L-M2、L-M3 和L-M4的動力學研究圖。d) L-M1、M5、L-M6和L-M7的動力學研究圖。e) L-P1、D-P1 和rac-P1在水（pH = 3）中的CD譜圖。f) L-P1在水（pH = 3）中、L-P6在乙腈中和L-P7在甲醇中的CD譜圖。

    隨后作者通過DFT計算驗證了L-M1側鏈上原位生成的叔胺基團通過與其仲氨基增長鏈末端的分子間氫鍵作用自促進其聚合（圖4）。通過位阻較小的八元環過渡態TSa1 (29.9 kcal/mol) 的路徑A的活化能顯著低于通過約束更大的四元環過渡態TSc1 (36.6 kcal/mol) 的路徑C的活化能。這表明伴隨著協同的親核加成-消除過程的路徑A更為有利。在路徑 A 中，在TSa中清楚地觀察到L-M1與增長鏈末端1之間的分子間氫鍵，隨后從增長鏈末端1到L-M1的叔胺側鏈的質子轉移產生了一個兩性離子中間體INTa1，該中間體進一步經歷快速的質子轉移到鄰近的氮原子，同時釋放出CO₂，該過程中叔胺側鏈充當質子轉移穿梭器，促進了協同的親核加成-消除過程。對化合物2（增長鏈末端的簡化結構模擬物）的¹H NMR分析顯示，隨著濃度增加，仲氨基質子的化學位移向低場移動（圖5），說明鏈末端會產生氫鍵，但也無法排除通過分子內氫鍵的五元環過渡態TSb1的路徑B。

圖4. 叔胺側鏈L-M1模型鏈的增長反應的DFT計算。

圖5. 化合物2在CDCl₃中濃度逐漸增加的¹H NMR譜圖

    隨后作者測定了聚合物螺旋的穩定性，當溫度從20°C升高到90°C，pH值從1.7增加到7.0時，L-P1 的螺旋結構幾乎不受影響（圖6a,b），且對強變性劑（包括鹽酸胍（GdnHCl）和尿素）表現出顯著的抵抗性（圖6c），作者通過化合物3（聚合物鏈模擬物）的兩種構象的N末端甲基質子峰的¹H NMR峰積分，確定了 K_cis/trans比率，在水溶液中約為2.5，并且在 pH 2到7的范圍內幾乎恒定（圖6d）。DFT計算表明化合物 4（L-P1中酰胺結構的簡化模擬物）在反式構象中的能量最小化結構顯示出比順式高2.049 kcal/mol，表明順式構象在熱力學上更有利（圖6e）。

圖6. a, b) L-P1在水（pH = 3）中在不同溫度和pH值下的CD譜圖。c) L-P1在水（pH = 3）中在25°C下，存在不同濃度尿素時的CD譜圖。d) 化合物3的K_cis/trans隨D₂O中pH值變化的曲線圖。e) 通過DFT計算得到的化合物4的能量最小化順式和反式酰胺結構。

    為了拓展應用場景，作者對L-P1進行功能化修飾，有烷基、芐基、可點擊炔基、羧基、磷酸酯和磺酸酯基團的多種季銨聚類肽（圖7a），¹H NMR表明實現了定量轉化。與多肽中陽離子側鏈通過靜電排斥誘導螺旋破壞不同季銨化的聚類肽盡管帶有靠近主鏈的帶電側鏈，卻保留了螺旋結構，且螺旋性顯著增強（圖7b, c），CD光譜證明后修飾產物同樣具有良好的熱穩定性（圖7d），這可能是修飾的乙基，增加了位阻，且在主鏈羰基氧原子與季銨側鏈之間形成的額外 C-H-O氫鍵增強了K_cis/trans比率，為了支持該假設，對化合物6（L-P1-Et中酰胺結構的簡化模擬物）進行了DFT計算（圖 7e），順式構象能量顯著更低，同時觀察到了在羰基氧原子與季銨側鏈中乙基的β-質子之間存在一個額外的氫鍵，化合物6的靜電勢表面（EPS）圖顯示了乙基上α和β質子的正電性證實了氫鍵形成的可能性。通過DFT 模擬獲得了具有5個重復單元的 L-P1-Et 模型。該低聚類肽表現出與L-P1-Et 相似的CD譜圖。能量最小化模型顯示了一個右手類PPI螺旋，其螺距（8.37 ?）比L-P1（6.40 ?）更寬，螺旋更為伸展。

圖7. a) L-P1 的季銨化。b-c) L-P1-neutral、L-P1-charged 和 L-P1-Et (DP=25) 分別在TFEA和Milli-Q水中，25°C下的CD 譜圖。d) L-P1-Et在Milli-Q水中溫度升高時的CD譜圖。e) 通過 DFT 計算得到的化合物6的能量最小化順式酰胺結構。f) 化合物6在順式酰胺結構中的相應EPS圖（紅色表示正電勢，顏色強度與電勢大小成正比）。g, h)通過DFT計算得到的L-P1-Et和L-P1-neutral具有5個重復單元的能量最小化模型。

    隨后作者使用A549細胞（肺癌人類肺泡基底上皮細胞）評估了該聚類肽的細胞毒性，與聚L-賴氨酸（L-PLys₂₅）（IC₅₀= 92 μg/mL）相比L-P1₂₅（IC₅₀= 354 μg/mL）和L-P1₂₅-Et（IC₅₀>1024 μg/mL）表現出更低的毒性，即使鏈長從50 DP延長到100 DP，細胞毒性仍然相對較低(IC₅₀=466和331 μg/mL)，（圖8a）這可能由于叔銨和季銨基團的取代基導致更離域的表面電荷，從而減少了與細胞膜的靜電相互作用。

    陽離子螺旋結構在控制細胞穿透肽（CPPs）的跨膜能力方面起著關鍵作用。將L-PLys₂₅，L-P1₂₅-Et，L-P1₂₅末端用羅丹明B（RhB）標記，并在A549細胞中研究了其攝取動力學（圖8b），觀察到L-P1₂₅具有更快的攝取速率，2小時內迅速發生，之后水平趨于穩定共聚焦熒光顯微鏡圖像進一步證實了L-P1₂₅的有效細胞攝取，清楚地顯示了RhB標記的L-P1₂₅在細胞內的熒光（圖8c）。L-P1₂₅比L-P1₂₅-Et更高的細胞攝取可能源于表面電荷密度和疏水性之間的最佳相互作用，因此可通過進一步調節電荷密度和疏水性，從而在保持相對較低細胞毒性的同時，實現增強的細胞攝取效率。

圖8. a) 用 L-PLys₂₅、L-P1₂₅、L-P1₅₀、L-P1₁₀₀和L-P125-Et處理A549細胞的細胞活力。b)L-PLys25、L-P125和L-P125-Et 在A549細胞中以10 μM濃度隨時間變化的攝取情況。c)A549細胞與L-P125、L-P125-Et和L-PLys25一起孵育的熒光圖像。細胞核在藍色通道中可見；細胞內的聚合物在紅色通道中可見；Merge代表藍色和紅色通道的疊加。

    總之，陽離子聚類肽的快速雙自促進聚合，結合結構多樣性和顯著的螺旋穩定性，為開發更先進的功能性螺旋聚合物提供了啟示。此外，這些水溶性的、高度堅固的螺旋陽離子聚類肽在各種應用中具有巨大潛力。例如，它們可用作自組裝中的剛性、親水鏈段，以構建獨特的結構。同時，低細胞毒性和高細胞攝取效率使它們成為設計新型細胞穿透、基因傳遞和抗菌劑材料的理想候選者。

作者：TCM

DOI: 10.1002/anie.202521129