分享一篇發表在Chem. Sci.上的文章，文章題目為“Affinity peptide ligands: new tools for chasing non-canonical N-phosphoproteome”，本文通訊作者為中國科學院大連化學物理所的江波副研究員和卿光焱研究員，前者研究方向主要為蛋白組學樣品預處理材料和方法，后者主要從事生物分離材料、智能聚合物與界面方面的研究。

可逆的蛋白質磷酸化是研究最為廣泛的翻譯后修飾（PTM）之一，幾乎參與所有的生命過程。磷酸化會發生在蛋白的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸上，發生在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸上的O-磷酸化由于其卓越的穩定性，成為研究的重點。隨著研究的深入，由于N-磷酸化也在生命過程中起著非常重要的作用，該修飾引起了越來越多的關注。但是N-磷酸化形成的N-P鍵在酸性條件下不穩定，所以目前開發的富集磷酸肽的方法均存在各自的缺點。因此，本文作者提出用肽配體來富集磷酸化的肽段，可以一定程度克服之前開發方法的缺陷，為磷酸化蛋白質組的研究提供新的選擇。

作者使用噬菌體展示技術來篩選對磷酸基團有較高親和力的多肽，實驗組是將噬菌體展示的多肽庫與N-磷酸化肽段pHFF進行孵育，為了消除選擇性地與肽骨架結合的肽配體，作者設置了非磷酸化的HFF肽進行陰性篩選。通過噬菌體展示，作者成功找到了4條與磷酸基團表現出較高親和力的多肽配體，使用ELISA選出與pHFF親和力最強的P-1配體。ITC測定了P-1與磷酸化肽段TSpHYSIMAR之間的親和力，解離常數為8.5 M.

之后作者將P-1配體偶聯到瓊脂糖磁珠表面，得到用于蛋白質組樣品制備過程中富集磷酸肽的磁珠，將磷酸肽以一定比例摻入蛋白質組樣品中，該磁珠可以有效地從樣品中富集到磷酸肽。

之后，作者將該磁珠用于不同模型中蛋白質組磷酸化的分析中。在HeLa細胞中，鑒定出 1995個新的N-磷酸化位點，與以前的方法相比，檢測深度大幅增加2至5倍，并顯著擴大了N-磷酸化蛋白質組數據庫的規模。此外，還發現N-磷酸化修飾高度集中在細胞核中。結合細胞核分離技術，首次鑒定了細胞核中1296個N-磷酸化位點，為揭示核蛋白中 N-磷酸化的功能提供了新的線索。最后，結合定量蛋白質組學方法，研究了阿爾茨海默病進展過程中N-磷酸化修飾的動態變化，為AD發病機制的研究提供了新的視角。

總而言之，本文作者利用噬菌體展示技術，篩選得到一個對磷酸基團有較高親和力的多肽配體，可用于磷酸化蛋白質組的富集。

本文作者：LZ

責任編輯：MB

DOI：10.1039/D5SC01557J

原文鏈接：https://doi.org/10.1039/D5SC01557J