內(nèi)容來(lái)源：藥研江湖

王睿睿* （斯百全化學(xué)（上海）有限公司

藥品中的雜質(zhì)定義為無(wú)任何療效、且可能引起副作用的物質(zhì)。因此，必須控制雜質(zhì)水平，以確保藥品的安全性達(dá)到人用要求。雜質(zhì)會(huì)影響藥品的安全性和研發(fā)時(shí)間，例如，藥物開(kāi)發(fā)中，如果必須采用多種手段進(jìn)行雜質(zhì)表征，并將其去除至可接受水平，所需時(shí)間將會(huì)顯著增加。根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）指南，原料藥相關(guān)的雜質(zhì)可分為三個(gè)主要類(lèi)別：有機(jī)雜質(zhì)、無(wú)機(jī)（元素）雜質(zhì)以及殘留溶劑。在這三類(lèi)中，遺傳毒性雜質(zhì)是一種特例，既便在低濃度條件下也有著重大的安全風(fēng)險(xiǎn)。這是因?yàn)樗鼈兛赡芫哂兄峦蛔冃裕赡軐?dǎo)致DNA 損傷，從而增加罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。

原料藥中的雜質(zhì)來(lái)源包括以下幾個(gè)方面：①原料及其污染物；②試劑和催化劑；③溶劑；④中間體；⑤降解產(chǎn)物；

為保護(hù)患者，需要將藥物的雜質(zhì)水平降到可接受的安全限度內(nèi)，因此各國(guó)都已相繼制定了雜質(zhì)控制指南，這些指南都專(zhuān)注于利用規(guī)定限度控制藥品中的雜質(zhì)含量，其中由ICH 與美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）制定的指南較權(quán)威且影響大。例如，ICH Q3A 通過(guò)制定雜質(zhì)的報(bào)告、鑒定和認(rèn)證閾值以監(jiān)管新原料藥中的雜質(zhì)。ICH Q3B 是其同等的新藥雜質(zhì)指南。ICH Q3C 和 ICHQ3D 分別控制殘留溶劑與重金屬元素雜質(zhì)的限量。

已經(jīng)正式生效的ICH M7 是ICH 專(zhuān)家工作組制定的一本關(guān)于藥物中DNA 反應(yīng)性雜質(zhì)的指南[5]，包括如何根據(jù)結(jié)構(gòu)活性分析來(lái)評(píng)估藥品中雜質(zhì)的潛在基因毒性，如何確定關(guān)鍵毒性閾值（毒性關(guān)注閾值TTC）。此外，還論述了一些特別復(fù)雜的問(wèn)題和情景，例如，為什么潛在基因毒性物質(zhì)具有相似的分子結(jié)構(gòu)，可能相同的反應(yīng)機(jī)理還不能合并用于TTC 的計(jì)算。另一個(gè)問(wèn)題是指南試圖對(duì)不同TTC 值進(jìn)行澄清，這依賴(lài)使用藥品的時(shí)間長(zhǎng)度。

ICH S2(R1) 指南中，將遺傳毒性定義為“ 一個(gè)廣泛的術(shù)語(yǔ)，指的是遺傳物質(zhì)中的任意有害變化，而不考慮誘發(fā)該變化的機(jī)制” 。而遺傳毒性雜質(zhì)定義為“ 經(jīng)過(guò)適當(dāng)遺傳毒性試驗(yàn)?zāi)Ｐ停纾?xì)菌基因突變（Ames）試驗(yàn)，證實(shí)具有遺傳毒性的雜質(zhì)”。潛在遺傳毒性雜質(zhì)（potentialgenotoxic impurity）定義為“ 具有遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，但未經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試模型驗(yàn)證” 。

3.1 在基因毒性雜質(zhì)來(lái)源方面的研究

Szekely 等提供了較詳細(xì)的分析，列出了具有基因毒性行為的警示結(jié)構(gòu)及與其有關(guān)的各種化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)被現(xiàn)代的制藥開(kāi)發(fā)及生產(chǎn)廠商普遍使用。同時(shí)還將這些基因毒性雜質(zhì)按照化學(xué)反應(yīng)中起到的不同作用進(jìn)行分類(lèi)：①來(lái)源于反應(yīng)物的結(jié)構(gòu)有鹵代烷、二羥基硫酸鹽、環(huán)氧化合物、肼、四甲基哌啶氧化物、芳香胺、硼酸；②來(lái)源于副反應(yīng)的結(jié)構(gòu)有：磺酸酯、鹵代烷、乙酰胺。

3.2 在基因毒性雜質(zhì)分析方面的研究

Liu 等報(bào)道了關(guān)于藥物中遺傳毒性雜質(zhì)痕量分析的研究進(jìn)展。這篇文章從行業(yè)角度闡述了化學(xué)品開(kāi)發(fā)中經(jīng)常遇到的不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型遺傳毒性雜質(zhì)的分析。

Elder 等描述了活性藥成分（API）和藥品中肼類(lèi)、酰肼類(lèi)和腙類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的分析。尤其值得注意的是其中使用了多種技術(shù)，包括色譜和光譜，且樣品大多進(jìn)行了衍生化處理。

Elder 等報(bào)道了API 中芐基鹵類(lèi)及其它相關(guān)活性有機(jī)鹵化物等潛在遺傳毒性雜質(zhì)的分析，并對(duì)分離技術(shù)進(jìn)行了分類(lèi)，包括配有不同檢測(cè)器（質(zhì)譜等）的氣相色譜和高效液相色譜，以及薄層色譜和毛細(xì)管電泳。

3.3 在基因毒性雜質(zhì)去除方面的研究

Robinson提出了一些遵守監(jiān)管指南的控制策略，并對(duì)每種方法進(jìn)行舉例說(shuō)明：①重新設(shè)計(jì)原料藥合成途徑，以避免引入有問(wèn)題的雜質(zhì)；②修改相關(guān)工藝參數(shù)，以去除此類(lèi)雜質(zhì)或?qū)⑵浣档椭敛伙@著的水平；③加深工藝?yán)斫猓宰C明特定的遺傳毒性雜質(zhì)不會(huì)生產(chǎn)或可被有效去除；④進(jìn)行毒性研究，以論證可以雜質(zhì)在設(shè)定的低濃度下不具有危害性。Szekely 等提出了在很多實(shí)際情況下，具有反應(yīng)活性和合成用途的反應(yīng)物及中間體很可能會(huì)與DNA 發(fā)生反應(yīng)，而且這類(lèi)化合物在藥物開(kāi)發(fā)階段很難避免使用以控制或者降低基因毒性雜質(zhì)，尤其是在工藝放大的階段更難實(shí)現(xiàn)，因此，目前普遍采用的策略為對(duì)基因毒性雜質(zhì)的預(yù)防，即關(guān)于除去或者降低關(guān)鍵合成步驟中的基因毒性雜質(zhì)的濃度。他們還分別從兩個(gè)方面討論去除基因毒性雜質(zhì)的方法：①改變合成反應(yīng)條件，包括改變反應(yīng)組分的比例；變換反應(yīng)組分的添加順序；改變起始物料的質(zhì)量或者制備方法；采用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念控制基因毒性雜質(zhì)等；②優(yōu)化API 純化過(guò)程，包括調(diào)整諸如反應(yīng)度、溶解度、蒸發(fā)度和電離度等沖洗因子和分離技術(shù)。

業(yè)界和各國(guó)的監(jiān)管機(jī)構(gòu)都已制定了特別針對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)的指南（表1）

其中與原料藥注冊(cè)密切相關(guān)的指南為① PhRMA 意見(jiàn)書(shū)；② EMA 雜質(zhì)限度及其問(wèn)答指南；③ FDA 行業(yè)指南（草案）；④ ICH M7。

4.1 PhRMA 意見(jiàn)書(shū)

2004 年P(guān)hRMA 成立了一個(gè)工作小組來(lái)討論遺傳毒性雜質(zhì)，成果以意見(jiàn)書(shū)的形式公開(kāi)發(fā)表。

由于這份意見(jiàn)書(shū)的制定和EMA 相關(guān)官方指南的制定舉措同時(shí)進(jìn)行，結(jié)果導(dǎo)致方法有部分重疊。例如PhRMA 文件使用了EMA 草案中毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）的概念，而EMA 最終版指南中推薦了由PhRMA 工作小組提出的分期TTC 方法。因此，這兩個(gè)文件在方法和側(cè)重點(diǎn)上互為補(bǔ)充。

PhRMA 文件引入了兩個(gè)重要的創(chuàng)新理念：1）遺傳毒性雜質(zhì)的五級(jí)分類(lèi)系統(tǒng) ①已知具有基因毒性（突變性）和致癌性的雜質(zhì)，包括已知的動(dòng)物致癌物和人類(lèi)致癌物，其遺傳毒性機(jī)制有可靠數(shù)據(jù)支持。雜質(zhì)的遺傳毒性本質(zhì)可由已發(fā)表的化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)加以證明。②已知具有基因毒性（突變性），但致癌性未知的雜質(zhì)，包括基于常規(guī)遺傳毒性試驗(yàn)證實(shí)有致突變性的雜質(zhì)。③具有警示結(jié)構(gòu)，但與API 結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)，同時(shí)和具有未知的基因毒性（突變性）潛力的結(jié)構(gòu)也無(wú)關(guān)，包括功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)與遺傳毒性相關(guān)的雜質(zhì)。然而，這些基團(tuán)還未作為單獨(dú)化合物進(jìn)行檢驗(yàn)，而是基于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和使用基礎(chǔ)知識(shí)的構(gòu)效關(guān)系（SAR）專(zhuān)家系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行鑒定。這些警示性的功能基團(tuán)不存在于API 的結(jié)構(gòu)中。有一些結(jié)構(gòu)被廣泛認(rèn)為具有與DAN 反應(yīng)的活性，如致突變作用。Müller 等[13] 提出的能與DNA 發(fā)生反應(yīng)的一些警示結(jié)構(gòu)（圖1）。

④含有與API 相關(guān)的警示結(jié)構(gòu)及與API 結(jié)構(gòu)相同的警示功能基團(tuán)的雜質(zhì)。⑤無(wú)警示結(jié)構(gòu)或未表現(xiàn)潛在遺傳毒性。迄今為止，這項(xiàng)策略已基本上成為業(yè)內(nèi)大多遺傳毒性雜質(zhì)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)。

2）臨床實(shí)驗(yàn)材料的分期TTC 概念 分期TTC 意味著可以根據(jù)劑量和臨床試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，使得劑量增加時(shí)TTC 降低，持續(xù)時(shí)間較短時(shí)TTC 提高（表2）。根本原因在于臨床試驗(yàn)的用藥持續(xù)時(shí)間有限，且總體暴露量相對(duì)較低。初始TTC 保守的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估意味著該方法對(duì)絕大多數(shù)物質(zhì)（強(qiáng)致癌物質(zhì)除外）具有很高的安全系數(shù)。分期TTC 值應(yīng)適用于開(kāi)發(fā)中的所有階段以及每一個(gè)化合物，以防多種遺傳毒性雜質(zhì)同時(shí)存在。這個(gè)概念的一個(gè)例外是強(qiáng)效致癌物。

兩個(gè)概念的引入旨在為行業(yè)在新藥開(kāi)發(fā)階段提供一些靈活性和風(fēng)險(xiǎn)減輕策略。同時(shí)，分期TTC 方法也是EMA 和FDA 遺傳毒性雜質(zhì)指南的一個(gè)基本要素。

4.2 EMA 指南

EMA 作為監(jiān)管機(jī)構(gòu)先驅(qū)，推行了處理遺傳毒性雜質(zhì)的詳細(xì)指南。制定草案的任務(wù)由專(zhuān)利藥品委員會(huì)（CPMP），如今稱(chēng)為人用藥品委員會(huì)（CHMP）的安全工作組（SWP）承擔(dān)。SWP 委員會(huì)認(rèn)為具有潛在遺傳毒性的雜質(zhì)是一個(gè)特例，沒(méi)有涵蓋在Q3A 和Q3B 指南中，因此當(dāng)初為了彌補(bǔ)ICH 指南中雜質(zhì)控制部分的空缺，特別是針對(duì)那些可能異常強(qiáng)效的潛在雜質(zhì)，例如潛在遺傳毒性雜質(zhì)。委員會(huì)建議在ICH 限度中加入基于風(fēng)險(xiǎn)的安全因素，這與Q3C 中使用的殘留溶劑方法類(lèi)似。為征詢(xún)公眾意見(jiàn)，在2002 年發(fā)表第一版草案，標(biāo)題為遺傳毒性雜質(zhì)限度意見(jiàn)書(shū)。并在2004 年發(fā)表完整版。從這次發(fā)表以后，歐洲藥品管理局的官方縮略名由EMEA 變更為EMA。2006 年6 月，EMA 的CHMP 發(fā)布了遺傳毒性雜質(zhì)限量指南的最終版。CHMP 安全工作組發(fā)布了一些問(wèn)答文件進(jìn)一步解釋說(shuō)明，極大地完善了該指南。文件適用于新原料藥中的遺傳毒性雜質(zhì)，也適用于一些現(xiàn)有活性物質(zhì)的新應(yīng)用，在這些應(yīng)用中，與已獲得授權(quán)的含有相同活性物質(zhì)的產(chǎn)品相比，其合成路線、工藝控制和雜質(zhì)分析的評(píng)估不能合理保證未引入新的或更高水平的遺傳毒性雜質(zhì)。在目前情況下將一個(gè)化合物歸類(lèi)為遺傳毒性物質(zhì)，一般意味著以可能直接損傷DNA 的物質(zhì)為重點(diǎn)的體外或體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，得出了陽(yáng)性結(jié)果。并在充分的后續(xù)試驗(yàn)中，評(píng)估了獨(dú)立的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)聯(lián)性。

指南建議將遺傳毒性雜質(zhì)分為具有充分（試驗(yàn)）證據(jù)證明其閾值相關(guān)機(jī)理的雜質(zhì)和無(wú)充分（試驗(yàn)）證據(jù)證明其閾值相關(guān)機(jī)理的雜質(zhì)。并建議將相關(guān)實(shí)驗(yàn)限定于特定雜質(zhì)，這些雜質(zhì)基于化學(xué)反應(yīng)知識(shí)、分子結(jié)構(gòu)、原材料中的雜質(zhì)類(lèi)型和含量，以及現(xiàn)有的遺傳毒性數(shù)據(jù)，可合理預(yù)測(cè)其具有遺傳毒性。

具有充分證據(jù)證明其閾值相關(guān)機(jī)理的遺傳毒性數(shù)據(jù)雜質(zhì)將按照ICH Q3C（R3）中的2 類(lèi)溶劑的方法進(jìn)行處理。該方法計(jì)算“ 每日允許暴露量（PDE）”。根據(jù)最相關(guān)動(dòng)物研究中的“ 未觀察到的作用的劑量” 或替代性的“ 觀察到最低作用的劑量”，并結(jié)合多種不確定因素所得。

4.3 FDA 指南草案

2008 年12 月，美國(guó)FDA 發(fā)布了行業(yè)指南草案，原料藥和成品藥中的遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)- 推薦方法。FDA 指南針對(duì)已知或可疑的潛在遺傳毒性和致癌雜質(zhì)的安全認(rèn)證提供了具體建議。指南描述了許多用以表征及減少患者暴露于遺傳毒素和致癌性雜質(zhì)導(dǎo)致的潛在癌癥風(fēng)險(xiǎn)的方法。這些方法與EMA 指南相似，包括三個(gè)步驟：①改變合成和/ 或純化路線，使相關(guān)雜質(zhì)生產(chǎn)最少，和/或最大程度去除相關(guān)雜質(zhì)；②將相關(guān)雜質(zhì)的日最大暴露指標(biāo)1.5 μg 作為總體目標(biāo)；③進(jìn)一步表征遺傳毒性和致癌性風(fēng)險(xiǎn)，以更好地支持適當(dāng)?shù)碾s質(zhì)限量指標(biāo)，無(wú)論是上限值還是下限值。

FDA 指南使用與EMA 指南相同或相似的方法；但是，他們也有一些關(guān)鍵區(qū)別（表3）。

4.4 ICH M7

已經(jīng)生效的ICH M7 題為：ICH M7 為限制在藥物中具有DNA 活性（誘變性）雜質(zhì)進(jìn)行的評(píng)估和控制以限制潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。該指南與現(xiàn)行的EMA 指南相似，特別是警示結(jié)構(gòu)、Ames 試驗(yàn)、TTC 概念的應(yīng)用及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的相關(guān)部分。此外，它還討論了其他問(wèn)題，例如怎樣處理具有相似作用機(jī)理的多種結(jié)構(gòu)相關(guān)遺傳毒性物質(zhì)，以及在計(jì)算TTC 時(shí)是否應(yīng)對(duì)它們求和。