今天分享一篇由蘇黎世聯邦理工學院（ETH Zürich）的Jeffrey Bode教授于2019年發表在Journal of the American Chemical Society上的文章，ChemicalSynthesis of Atomically Tailored SUMO E2 Conjugating Enzymes for the Formationof Covalently Linked SUMO–E2–E3 Ligase Ternary Complexes.Jeffrey Bode教授研究領域主要包括多肽和蛋白質的合成，飽和氮雜環的制備以及通過“合成發酵”法制備有機分子。
泛素化（Ub）、SUMO化和其他的ubiquitin-like（Ubl）修飾過程涉及泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3的一系列反應，它們與底物蛋白之間的特異性相互作用是由蛋白-蛋白相互作用介導并受多種因素調節。Krist和Statsyuk通過對E2表面暴露的Cys殘基進行位點特異性修飾引入二嗪使E2 UbcH7與泛素連接酶E3 E6AP進行光交聯。但是這種方法僅用于捕獲HECT型連接酶，不適用于其他類別的E3。作者考慮到在大多數情況下泛素結合酶E2的大小適中（150-180個殘基），可以通過化學合成帶有任何所需修飾的基于E2的探針。
在本文中，作者組合使用了三種化學連接方法，，包括天然化學連接（NCL）、α-酮酸-羥胺（α-ketoacid-hydroxylamine: KAHA）連接和絲氨酸/蘇氨酸連接（serine/threonine ligation: STL），化學合成了帶有特定非天然氨基酸修飾的SUMO綴合酶Ubc9變體。這種方法可以在短時間內制備許多在不同位點帶有多個修飾的Ubc9變體。這些突變體可用于（1）將Cys93替換為2,3-二氨基丙酸（2,3-diaminopropionic acid: Dap）以形成穩定的E2-SUMO復合物；（2）光反應性基團（雙吖丙啶）在紫外線照射下捕獲E3連接酶；（3）用于純化和檢測的N端生物素（Figure 1）。
本文中，作者選擇了SUMO E2綴合酶Ubc9進行化學合成并引入光親和標簽，以構建基于E2連接酶的探針。Ubc9是一種具有158個氨基酸殘基的結合酶，其特征在于激活酶E1將SUMO轉移到Cys93上形成E2-SUMO復合物，盡管空載的E2通常對E1具有很高的親和力，但E2-Ub/Ubl復合物的形成會引起構象變化導致對E3連接酶的親和力更高，從而合成的E2可作為化學探針來鑒定E3連接酶。
作者選擇Ubc9的Gly34–Thr35、Lys74–Cys75和Ile107–Thr108作為連接位點（Scheme 1）。首先通過Fmoc-SPPS在2-Cl三苯甲基樹脂上制備用于STL連接的片段S1，在樹脂裂解和整體脫保護后C末端被轉化為水楊醛酯。S2是在負載有肼的2-Cl三苯甲基樹脂上制備，接著用NaNO2氧化形成疊氮后與3-巰基丙酸反應形成末端硫酯。然后通過STL將片段S1和S2組裝在一起（Scheme 1）。接下來，作者在Rink{attr}2124{/attr}樹脂上使用被保護的異亮氨酸α-酮酸作為C-末端殘基，裂解和整體脫保護后獲得了含有C端α-酮酸片段S3。通過常用方法以Boc-(S)-5-oxaproline作為N-末端殘基合成片段S4。然后通過KAHA將S3與S4連接，在堿性條件下進行O到N的酰基轉移得到S6（Scheme 1）。S5和S6直接進行NCL反應生成全長Ubc9蛋白。
已有研究表明穩定的Ubc9–SUMO復合物會優先與E3連接酶相互作用，所以為了在Ubc9和SUMO之間形成穩定的酰胺鍵，作者將Ubc9的Cys93突變為Dap。此外作者還引入帶有光交聯側鏈的非天然氨基酸用于蛋白質偶聯。最后，為了促進親和純化和生化檢測，作者在N端安裝了生物素標簽（Scheme 2）合成了一系列Ubc9變體。
接下來，作者使用RanGAP1作為底物，在ATP依賴的SUMOylation分析中評估了合成的Ubc9變體（圖2a）。使用市售的重組Ubc9作為陽性對照，Ubc9（Thr108Hse）的活性與重組Ubc9并無區別，RanGAP1能夠被SUMO的三種亞型（SUMO1，SUMO2和SUMO3）SUMO化（Figure 2b, lanes 3 and 2, 9 and 8, and 12 and 11）。為了評估攜帶Cys93Dap突變的Ubc9變體與SUMO形成復合物的能力，在激活酶E1和ATP的存在下將SUMO1與Ubc9進行體外偶聯反應，對于Ubc9（Thr108Hse，N-biotin），觀察到單一的SUMO化形式（Figure 2c, lanes 1 and 2），且SUMO1與Ubc9（Cys93Dap, Thr108Hse, N-biotin）的結合（Figure 2c, lanes 3 and 4）取決于ATP和E1（Figure 2c, lanes 6 and 7）。
為了研究雙吖丙啶是否可以選擇性地與E3連接酶偶聯，作者選擇了可有效增強Sp100 SUMOylation的E3連接酶RanBP2。為了測試Ubc9變體中雙吖丙啶的反應性，作者嘗試使用Sp100作為底物蛋白捕獲RanBP2，發現使用Cys93Dap變體Ubc9（F22F*, Cys93Dap, Thr108Hse, N-biotin）時觀察到形成了清晰的新的條帶（Figure 3b, lane 6, red triangle; Figure 3c, entry 2 ）。接下來通過一系列對照試驗（Figure 3）發現E3連接酶和底物蛋白的結合能夠有效促進其與SUMO1–Ubc9共價復合物的結合。
最后，為了研究Ubc9（F22F*, Cys93Dap, Thr108Hse, N-biotin）能否捕獲細胞裂解物中的內源性RanBP2，作者構建了Ubc9–SUMO1探針，并在存在底物Sp100的情況下與HEK293T細胞裂解物一起孵育，富集和純化后進行了蛋白質組學分析發現內源性RanBP2能夠被Ubc9（F22F*, Cys93Dap, Thr108Hse, N-biotin）捕獲，通過對照試驗發現E3連接酶（RanBP2）的捕獲取決于光交聯基團和紫外線照射。
綜上所述，作者提供的方法為構建各種Ubc9變體提供了一個平臺，以研究它們與其他蛋白質的相互作用，為開發復雜的蛋白質探針提供了可能。
原文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b06820
