分享一篇近期發表在Journal of the American Chemical Society上的文章，題為：Topologically Engineered Supramolecular Cyclolipid Nanoparticles: A Custom-Tailored Delivery System for Inhaled Combination Therapy。該文章的通訊作者為來自清華大學的喻國燦副教授。
肺部疾病每年會在全球范圍內導致近400萬人死亡，屬于常見且重要的疾病，而基于siRNA的RNA干擾療法（RNAi）為此類疾病的治療提供了一個有前景的策略。siRNA作為一種帶負電的親水生物大分子，容易在體內被清除，難以直接穿透細胞膜，且肺部疾病可以采用的吸入給藥雖然具有靶向優勢，卻也對siRNA遞送系統提出了更高的要求：需要在肺部環境中保持穩定，并實現有效的粘液滲透和內體逃逸。為了克服這些障礙，一系列脂質納米顆粒（LNPs）遞送系統被開發，但內體逃逸效率都不理想。因此，亟需開發出能同時實現高效的內體逃逸和卓越的循環穩定性的新型遞送系統。
本文中，作者設計并合成了一種基于β-環糊精（β-CD）的可電離環脂，通過靜電、疏水、主-客體相互作用形成CNPs@siHsp47/PFD共遞送靶向熱休克蛋白4的siHsp47和抗纖維化藥物吡非尼酮（PFD），并添加10%的PEG-Lipid穩定納米顆粒。該環脂具有復雜的錐形拓撲結構，可以誘導內體膜從層狀相向六角相轉變，從而破壞膜穩定性，提高內體逃逸效率，并具有出色的生理穩定性。如圖1所示。
圖1. CNPs@siHsp47/PFD的組分示意圖
作者首先根據β-CD伯羥基和仲羥基反應活性的不同進行選擇性修飾，得到一側有7個叔胺和7個仲胺，一側有14個疏水烷基鏈的可電離環脂，可電離基團與烷基鏈的比例與商用可電離脂質SM-102相似。但是由環脂制備的CNPs由于聚集無法在生理環境中保持穩定，因此作者又將PEG-Lipid共組裝進入 CNPs，發現10% PEG-Lipid摻入得到的CNPs表現出最好的穩定性，且siRNA遞送效率也高于未摻入組和5%摻入組，因此選擇含有10%PEG-Lipid的CNPs進行后續研究。與LNPs相比，CNPs的臨界膠束濃度更低，在血清中穩定性更高，證明了CNPs的體內應用潛力。如圖2所示。
圖2. 可電離環脂的合成及穩定性測試
為了驗證CNPs在內體逃逸中的優勢，作者通過多尺度分子動力學模擬與實驗分析系統探究了其作用機制。分子動力學模擬顯示，基于β-CD的錐形環脂在相同條件下的滲透速率顯著高于SM-102，這是因為體積龐大并具有高親脂性的環脂在穿透磷脂雙分子層時會引發膜局部顯著形變，膜分子被迫重排或遷移，導致結構完整性被破壞，最終因應力集中超出膜彈性極限而破裂。相比之下， SM-102僅引起輕微形變，膜結構保持完整。利用FRET實驗定量研究內體模擬脂質體的膜破裂程度，CNPs組遠超LNPs組，與理論計算結果相符。如圖3所示。
圖3. 錐形拓撲結構促進內體逃逸
PFD是FDA批準的抗纖維化藥物，可以通過下調轉化生長因子β1（TGF-β1）信號通路來緩解纖維化。β-CD的最大內徑為7.8 ?，而PFD中芳香環的寬度約為6.2 ?，因此環脂可以通過主-客體相互作用負載PFD，作者通過1H NMR、2D NOESY NMR、靜電勢圖譜（ESP）和等溫滴定量熱法（ITC）證明了PFD的有效包封。得益于這一相互作用，CNPs對PFD的封裝效率顯著高于LNPs，且在藥物釋放更緩慢。經鼻給藥后，CNPs@PFD在肺部的保留率遠超游離PFD和LNPs@PFD，且肝臟積累極低，具有優異的肺靶向性與穩定性。如圖4所示。
圖4. β-CD通過主-客體相互作用包封PFD
作者又通過多維度實驗驗證了CNPs在RNA遞送與肺纖維化協同治療中的高效性。CNPs通過高密度離子化頭部靜電作用穩定結合siRNA，細胞攝取率與LNPs相當，并且在24小時內實現高效內體逃逸。抗纖維化方面， CNPs@siHsp47/PFD可明顯抑制Hsp47 mRNA和蛋白的表達，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等其他纖維化相關蛋白表達水平顯著降低，成纖維細胞遷移率也明顯降低。與靜脈注射相比，經鼻吸入給藥可以實現更好的肺部富集， 而30小時后，CNPs在肺部的保留顯著優于LNPs。如圖5所示。
圖5. CNPs@siHsp47/PFD協同治療肺纖維化
為了進一步提高CNPs的肺部遞送效率，作者通過不同的渦流時間合成了三種不同尺寸的納米顆粒，通過調整N/P比調控CNPs的ζ電位。將這12種CNPs注射到小鼠體內，發現300 nm左右的NPs有利于肺部靶向遞送，主要是肺上皮細胞被轉染，其次是免疫細胞和內皮細胞。作者又利用粘蛋白和海藻酸鹽模擬氣道粘液屏障，測量CNPs的穿透深度，結果發現大尺寸的CNPs穿過粘液屏障的能力更強，這可能是因為小尺寸的納米顆粒傾向于通過小口徑的通道擴散，會有更多的彎曲和死角，而較大的納米顆粒可以直接通過更寬的通道實現滲透。如圖6所示。
圖6. CNPs的尺寸與ζ電位優化
最后作者通過博來霉素（BLM）誘導的小鼠肺纖維化模型評價了CNPs@siHsp47/PFD的協同治療效果。結果顯示，小鼠體重在治療后期顯著恢復，且肺部出血性壞死明顯減輕，Hsp47、α-SMA及Col1A1的表達水平顯著降低，肺泡增厚和間質水腫得到有效緩解，纖維化面積、Ashcroft評分、肺組織羥脯氨酸、肺系數下降，接近健康鼠。如圖7所示。
圖7. 小鼠肺纖維化模型中CNPs@siHsp47/PFD的治療效果
綜上所述，本文合成了一種具有錐形腔、可電離頭部和疏水尾部的新型拓撲工程化環脂，能夠促進納米顆粒實現快速的內質網逃逸，同時保持生理穩定性，實現siRNA和藥物的高效共遞送。添加PEG-Lipid后形成二元環脂納米顆粒（CNPs），為吸入式給藥提供了一個強大的平臺，克服了傳統LNPs的局限性，具有廣闊的臨床應用前景。
作者：YXM
DOI: 10.1021/jacs.5c03033
Link:https://pubs.acs.org/10.1021/jacs.5c03033
