分享一篇發(fā)表在Nature Methods上的文章：Genetically encoded biosensor for monitoring spatiotemporal dynamics of CCR2 ligands in culture and in vivo，通訊作者是來自西湖大學的Kiryl D. Piatkevich研究員，該課題組的研究方向是研發(fā)和設計尖端分子和成像技術，用于分析、控制和修復復雜生物系統(tǒng)。

趨化因子（如CCL2等）通過與G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）CCR2結合，調控免疫細胞在發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和炎癥中的遷移，是免疫系統(tǒng)的關鍵信號分子。然而，由于現(xiàn)有檢測技術（如ELISA、質譜、qPCR）無法實時、動態(tài)、高分辨率地追蹤體內趨化因子的時空分布，其在活體中的精確釋放模式一直未被闡明。

為了解決這一難題，本文作者通過基因工程開發(fā)了遺傳編碼熒光傳感器CRAFi-CCR2（Human Chemokine-Receptor Activation-based Fluorescent indicator-CCR2），首次實現(xiàn)了對CCR2配體（尤其是CCL2）在體外和體內的實時、高靈敏度、空間特異性監(jiān)測，為研究免疫調控、神經炎癥及腫瘤微環(huán)境提供了強大工具。CRAFi-CCR2傳感器設計的原理是以人源CCR2B受體為骨架，在其第三胞內環(huán)插入環(huán)化綠色熒光蛋白（cpGFP），通過構象變化將配體結合信號轉化為熒光信號。在傳感器優(yōu)化方面，作者通過定點突變的方式去篩選效果更好的linker和cpGFP結構域。

然而，由于趨化因子價格太高且目前尚無針對CCR2的小分子激動劑，作者在進行大規(guī)模突變體篩選前，為了提高篩選效率并降低成本，將CellSorter設備改造成自動藥物輸送系統(tǒng)iDrug。該系統(tǒng)可以往96孔板的細胞中添加低至5 μL的配體溶液，并自動記錄熒光強度的變化。

使用該系統(tǒng)，作者篩選了~331個突變體，并獲得CRAFi-CCR2，其響應mCCL2的熒光增加~300%，在星形膠質細胞中具有納摩爾級別的親和力（2.5 nM）。此外，為了進一步改善傳感器的膜定位，作者將其與高爾基體輸出運輸信號（KGC）和內質網輸出（ER2）序列融合。通過一系列的性能表征實驗，作者證明了CRAFi-CCR2具有較高的特異性，僅響應CCR2配體（如CCL2、CCL7、CCL8等）。另外，作者還證明了CRAFi-CCR2的激活并不會影響下游的信號通路，例如鈣動員和受體內化。

在優(yōu)化好方法后，作者在體外細胞炎癥模型中實時監(jiān)測CCL2釋放，它們進行了17-20 小時的實時成像，并且在小鼠大腦中，觀察到CCL2 信號響應的空間異質性，強調了免疫系統(tǒng)時空信號傳導的復雜性。

綜上所述，本文作者開發(fā)了一種生物傳感器CRAFi-CCR2，首次實現(xiàn)了活細胞以及活體動物中趨化因子動態(tài)變化的實時監(jiān)測。

本文作者：MB

責任編輯：LZ

DOI：10.1038/s41592-025-02742-y

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