分享一篇發(fā)表在JACS上的文章，題目為“Sensitive and Accurate Detection of Low-frequency Mutations via Pyrophosphorolysis-Activated Selective Amplification and MALDITOF-MS Single-Nucleotide Resolution Identification”。通訊作者是來自廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院的楊朝勇教授和福建醫(yī)科大學(xué)的許醒老師，他們的主要研究方向包括分子診斷、生物傳感器與液體活檢技術(shù)等。
體內(nèi)各種細(xì)胞正常生理性死亡后，它的DNA會被切割成短的片段并釋放到血液中，這些DNA片段被稱為細(xì)胞游離DNA（cfDNA）。其中有部分是由腫瘤細(xì)胞釋放出來的，被稱為循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）, 它們攜帶了腫瘤特有的基因變異信息。在精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，利用cfDNA進(jìn)行液體活檢對癌癥的早期篩查、療效監(jiān)測和預(yù)后評估至關(guān)重要。然而，這一技術(shù)的核心挑戰(zhàn)在于，如何從海量的野生型（WT）cfDNA背景中，精準(zhǔn)地檢出極微量的ctDNA突變。現(xiàn)有的方法，如二代測序（NGS）和擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)定量PCR（ARMS-qPCR），在靈敏度、多重檢測能力或成本方面存在局限，難以滿足臨床對超低頻突變（如變異等位基因頻率VAF < 0.1%）檢測的需求。
基于此，作者創(chuàng)新性地開發(fā)了一個(gè)名為雜交超靈敏核酸靶向富集與讀出平臺（HUNTER）。HUNTER的核心技術(shù)原理在于巧妙地結(jié)合了焦磷酸解活化聚合（PAP） 的高特異性擴(kuò)增與基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS） 的高精度檢測。
首先，在靶向富集階段，HUNTER利用了PAP技術(shù)獨(dú)特的“開關(guān)”機(jī)制。 與傳統(tǒng)ARMS-qPCR依賴聚合酶被動識別末端錯配不同，PAP技術(shù)的引物在其3’末端被一個(gè)雙脫氧核苷單磷酸（ddNMP）所“封閉”，使其無法直接延伸。只有當(dāng)引物與突變DNA模板完全互補(bǔ)時(shí)，DNA聚合酶才能在焦磷酸（PPi）存在下，啟動焦磷酸解反應(yīng)，精確地“切除”這個(gè)末端阻斷基團(tuán)，從而“解鎖”引物，開啟后續(xù)的擴(kuò)增。而對于野生型模板，由于存在末端錯配，焦磷酸解反應(yīng)無法發(fā)生，引物始終保持“關(guān)閉”狀態(tài)。這種主動的、酶控的“解鎖”機(jī)制，從源頭上極大地抑制了野生型背景的擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對低頻突變的選擇性富集。
隨后，在信號讀出階段，HUNTER摒棄了傳統(tǒng)的熒光檢測法，采用了MALDI-TOF-MS進(jìn)行直接質(zhì)量檢測。 經(jīng)過PAP富集的產(chǎn)物，會進(jìn)行一步單堿基延伸反應(yīng)。針對每一個(gè)需要檢測的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一條短的延伸引物。這條引物的3’端會緊貼著突變位點(diǎn)，但不包含突變位點(diǎn)本身。這條引物會特異性地退火到PAP擴(kuò)增出的單鏈DNA模板上。該反應(yīng)使用四種分子量各不相同的雙脫氧核苷酸（ddNTP），使得延伸產(chǎn)物因所摻入堿基的不同而具有獨(dú)特的分子量。MALDI-TOF-MS則能像一臺精密的“分子秤”，直接讀出這些產(chǎn)物的質(zhì)量，從而實(shí)現(xiàn)對突變類型的單核苷酸分辨率鑒定。這種方法避免了熒光檢測中常見的信號交叉和光譜重疊問題，為多重檢測和高特異性分析奠定了基礎(chǔ)。
研究結(jié)果表明，HUNTER平臺展現(xiàn)出卓越的性能：其檢測限低至0.01% VAF或3個(gè)拷貝的突變，并能在單次反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)10重檢測，同時(shí)對臨床樣本的分析保持了100%的特異性。
總而言之，作者開發(fā)的HUNTER平臺，通過將PAP的高特異性富集能力與MALDI-TOF-MS的精準(zhǔn)檢測能力相結(jié)合，成功地解決了液體活檢中超低頻突變檢測的瓶頸。這一技術(shù)不僅靈敏度與特異性俱佳，而且具備多重、快速和成本低廉的優(yōu)勢，為癌癥早期診斷、微小殘留病灶監(jiān)測及精準(zhǔn)用藥打開了新的局面，有望成為下一代分子診斷的有力工具。
本文作者：TZM
責(zé)任編輯：TZS
DOI：10.1021/jacs.5c08741
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c08741
