分享一篇發表在Angew上的文章。文章的題目是Activity-Based Ubiquitin Probes Capture the Sulfenylated State of Deubiquitinases。文章的作者是來自湖南大學生命醫學交叉研究院的黃靜教授。該課題組研究方向包括DNA損傷修復機理與基因組的穩定性、生物大分子的化學調控、靶向藥物的設計及其作用機理研究等。

泛素化是一種可逆的蛋白質翻譯后修飾，其逆轉過程由去泛素化酶（DUB）催化。DUB的活性依賴于其活性中心的低pKa半胱氨酸殘基，該殘基對氧化還原狀態敏感，是細胞氧化應激響應中的關鍵調控靶點。DUB催化半胱氨酸可被可逆氧化為次磺酸（─SOH），也可進一步不可逆氧化為亞磺酸（─SO?H）或磺酸（─SO?H）。其中，次磺酸化（DUB-SOH）作為重要中間態，可逆地抑制DUB活性，進而影響蛋白質運輸、折疊、翻譯及DNA修復等過程，在癌癥和神經退行性疾病中具有病理意義。

為研究DUB活性及調控，基于活性的泛素探針（Ub-ABP）已成為關鍵工具。傳統Ub-ABP（如Ub-PA）主要靶向還原態DUB，難以捕捉氧化還原調控過程。為此，本研究開發了一類新型Ub-ABP，通過在泛素C端引入次磺酸反應彈頭，可在體外和細胞裂解物中選擇性標記次磺酸化DUB。結合定量質譜，該工具為在生理條件下解析泛素系統的氧化還原調控機制提供了有力手段。

探針由兩部分構成：泛素支架用于靶標識別，次磺酸反應彈頭實現共價捕獲。本研究選取了三類彈頭：經典且生物相容性高的二甲酮（dimedone）、結構緊湊且反應性更強的PRD衍生物，以及通過親電機制實現快速捕獲的降冰片烯類試劑，并基于此構建了DUB-SOH靶向探針。

為評估探針反應性，作者選用對氧化敏感的去泛素化酶USP2的催化結構域USP2CD進行測試。結果顯示，Biotin-Ub75-DYn-2對氧化態USP2CD標記效率最高，Biotin-Ub-PRD效果較弱，Biotin-Ub-NMA因空間位阻無標記。傳統探針Biotin-Ub-PA僅有效標記還原態USP2CD，證實其難以捕獲氧化態DUB。

后續作者評估了Ub73/74/75-DYn-2系列探針標記氧化USP2CD和UCHL3的能力，發現Ub74-DYn-2效率最高。分子模擬顯示其彈頭與催化半胱氨酸距離最近（1.8 ?），空間取向最優。競爭實驗證實其對次磺酸的選擇性。LC-MS/MS分析直接鑒定到Cys95上的DYn-2加合物，證實了位點特異性共價標記。

后續作者優化了H?O?濃度，發現100 μM時Ub74-DYn-2對USP2CD和UCHL3的標記最強，更高濃度導致過度氧化為不可逆形式，標記消失。該探針與UCHL1反應迅速，1分鐘內完成標記。DTT處理可逆轉100 μM H?O?引起的標記損失，證實其捕獲可逆次磺酸化修飾；而1 mM H?O?導致不可逆失活。LC-MS/MS顯示在適度氧化條件下，約51.9%的氧化UCHL3為次磺酸形式。在細胞裂解物中，Ub74-DYn-2能有效檢測內源性氧化態UCHL3，且標記可被DUB抑制劑PR-619抑制，證明其特異性作用于催化半胱氨酸。

后續作者利用Biotin-Ub74-DYn-2對H?O?處理的HEK293T細胞裂解物進行蛋白質組學分析，鑒定出13種顯著富集的次磺酸化DUB和4種E3連接酶，涵蓋USP、OTU、UCH和MINDY等家族。其中UCHL3的次磺酸化水平最高，并通過免疫印跡得到獨立驗證。該探針實現了對氧化還原敏感DUB組的全蛋白質組尺度選擇性檢測，為研究泛素系統的氧化還原調控提供了有效工具。

作者進一步在線粒體應激模型（CCCP處理）中測試探針，發現內源性ROS也可誘導多種DUB和E3（如OTUD4和A20）發生次磺酸化，并經蛋白質組學和免疫印跡驗證。結果表明，Biotin-Ub74-DYn-2不僅能捕獲外源H?O?引起的氧化，還可檢測生理性內源ROS導致的DUB次磺酸化，具備良好的生理相關性。該探針展現出在復雜系統中研究DUB氧化還原調控的強大潛力。

本文作者：THT

責任編輯：LYC

DOI：10.1002/anie.202512311

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/anie.202512311