分享一篇發(fā)表在JACS上的文章，標(biāo)題為“Live-Cell Monitoring and Omics Analysis of Liquid–Solid Transitions of Biomolecular Condensates”，通訊作者為分別來自日本九州大學(xué)、東京大學(xué)、大阪大學(xué)、京都大學(xué)的Yuichiro Hori, Takeaki Ozawa, Kazuya Kikuchi和Motonari Uesugi，研究興趣為熒光探針與活細胞成像技術(shù)開發(fā)。

生物凝聚物是由液液相分離過程形成的無膜細胞器，發(fā)揮著重要的生理功能。然而，在一些條件下，這些凝聚物會隨時間由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，這一現(xiàn)象與多種疾病密切相關(guān)，如肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）和額顳葉變性（FTLD）等。然而，傳統(tǒng)的生物凝聚物成像方法，如融合熒光蛋白，無法區(qū)分液態(tài)與固態(tài)的凝聚物；而可以區(qū)分液固狀態(tài)的光漂白后熒光恢復(fù)（FRAP）技術(shù)耗時長，通量低，不適用于大規(guī)模篩選。

因此，作者利用光活性黃色蛋白（PYP）及其特異性熒光共價配體對活細胞中凝聚物的液固狀態(tài)進行成像。PYP是一種體積較小的細菌蛋白，可與4-羥基肉桂酸和多種非天然熒光配體通過共價反應(yīng)結(jié)合。作者發(fā)現(xiàn)，固態(tài)凝聚物阻礙了凝聚物中的PYP蛋白與其共價配體的反應(yīng)，因此PYP可用于分辨凝聚物的液固相狀態(tài)。作者將FUS（P525L）（一種病理相關(guān)的凝聚物蛋白突變體）的PYP融合蛋白轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中，首先添加PCAF-orange標(biāo)記含有PYP的凝聚物，隨后孵育48小時誘導(dǎo)凝聚物向固態(tài)轉(zhuǎn)變，再添加PCAF-far-red進行標(biāo)記。在此模式下，新形成的凝聚物僅被遠紅熒光標(biāo)記，始終保持液態(tài)的凝聚物會被兩種熒光分子標(biāo)記，而由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的凝聚物僅被橙色熒光標(biāo)記。

作者發(fā)現(xiàn)，雙標(biāo)記的凝聚物經(jīng)過孵育可以融合為更大液滴，但它們無法與僅橙色標(biāo)記的凝聚物融合，證明前者為液態(tài)而后者為固態(tài)。作者還使用FRAP技術(shù)證明了遠紅熒光與橙色熒光比率較低時，光漂白的回收率也較低，進一步證明低遠紅熒光標(biāo)記的凝聚物為固態(tài)。

作者開發(fā)的方法還與熒光激活細胞分選（FACS）兼容，在兩種熒光分子標(biāo)記后，作者可通過orange/far-red熒光比例量化固化程度。通過轉(zhuǎn)染12種相分離蛋白的PYP融合蛋白并進行流式評估，作者發(fā)現(xiàn)TDP-43及其A315T突變體最易導(dǎo)致固化。

最后，作者對分選得到的細胞群進行了蛋白質(zhì)組分析和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)凝聚物固化的細胞中細胞外基質(zhì)蛋白（如COL1A2、LAMC1）顯著上調(diào)，說明固態(tài)凝聚物形成與細胞外基質(zhì)硬化之間可能存在以前未被認(rèn)識到的聯(lián)系。

總之，作者利用光活性黃蛋白及其特異性熒光共價配體對活細胞中蛋白質(zhì)凝聚物的液-固態(tài)轉(zhuǎn)化進行成像，并進行了組學(xué)分析。

本文作者：ZCL

責(zé)任編輯：LZ

DOI：10.1021/jacs.5c07340

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c07340