重氮化合物（diazo compounds）是一類重要的中間體，被廣泛應用于有機合成、藥物研發、生物化學、高分子材料化學中。與疊氮相比，重氮基團具備改善的環加成反應動力學、可調的反應活性、豐富的電子，以及增加的HOMO能級等優勢。
1993年，Badet課題組首次報道了基于N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）酯的重氮酰化試劑（1，圖1a），該試劑后被用來修飾一些小分子和生物分子，包括牛血清白蛋白（bovineserum albumin，BSA）。2018年，Gaunt研究團隊闡述了利用高價碘試劑（2，圖1a）靶向甲硫氨酸殘基，在多肽和蛋白質上安裝親電重氮基團的過程。
近期，英國劍橋大學Gon?alo J. L.Bernardes研究組在Bioconjugate Chemistry上發表了題為Precise installation ofdiazo-tagged side-chains on proteins to enable in vitro and in-cellsite-specific labeling的研究論文。文中開發了新的重氮羰基丙烯酸衍生物，該試劑可以快速地與蛋白質和抗體上的半胱氨酸殘基發生化學選擇性的硫醇加成反應，實現了在特定位點快速精確引入重氮基團的目標，為探索化學生物學中新的生物正交反應提供了可能（圖1c）。
圖1. 可在生物分子中引入重氮基團的選擇性試劑。a. 已報道的用于多肽和蛋白質修飾的非特異性試劑1和2；b. 本文設計的重氮羰基丙烯酸試劑3；c. 重氮基團被引入目標生物分子后，可被多種活性探針標記。本文借助的是重氮與張力型炔烴的1,3-偶極環加成反應。
實驗中，作者首先利用HWE（Horner-Wadsworth-Emmons）成烯反應合成了重氮羰基丙烯酸試劑（3，圖1b）。室溫下，將試劑3分別與N-Boc-Cys-OMe（6a，圖2）和N-Cbz-Cys-OMe（6b，圖2）反應，可生成重氮硫醚產物7a/7b，產率分別為90%和88%。同時，高效液相色譜層析（high performanceliquid chromatography，HPLC）分析發現，溶液中有還原型GSH時，重氮基團仍能穩定存在。另外，7b和10均可與張力型炔烴8發生環加成反應，得到吡唑類產物9和11（圖2）。
圖2. 重氮羰基丙烯酸試劑對Cys的修飾。a. α,β-不飽和重氮酮3的合成；b. N-Boc-Cys-OMe6a和N-Cbz-Cys-OMe6b分別與化合物3反應10min，生成重氮硫醚產物7a和7b；c. 室溫下，7b與還原型GSH在pH7.4 NaPi緩沖液中共孵育24h的穩定性；d、e. 7b和10與張力型炔烴8的環加成反應；f. 從原料10到產物11反應過程中HPLC圖像變化。
作者利用量子力學計算證實了張力型炔烴反應活性的增強（圖3）。根據計算出的前沿分子軌道（FrontierMolecular Orbital，FMO）推測，重氮酮是缺電子試劑，可與線性或張力型炔烴發生逆電子需求（inverse-electrondemand，IED）的環加成反應。而由張力促進的環加成反應活性增強，主要基于張力型炔烴轉變為過渡態構象所需能量較低。
圖3. 量子力學計算獲得的重氮化合物7’和10分別與張力型炔烴8’和12’發生1,3-偶極環加成反應的最低能量結構。
作者進一步探索了半胱氨酸特異性的重氮試劑與不同蛋白質間的生物偶聯作用（圖4）。首先，將試劑3分別與泛素蛋白Ub、突觸結合蛋白Ⅰ（synaptotagmin-Ⅰ）的C2A結構域（C2Am）、膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）、人源白蛋白變體AlbuminⅤ0354共孵育。對比實驗結果發現，蛋白質完全標記時所需試劑3的用量取決于Cys的反應活性、化學微環境和可得性（圖4b-e）。同時，液相色譜串聯質譜（liquidchromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對C2Am-3胰蛋白酶消化產物的分析結果表明，試劑3具有半胱氨酸選擇性（圖4f）。此外，利用圓二色譜（circular dichroism，CD）對Albumin和Albumin-3進行分析也發現，重氮基團的引入并不影響蛋白質的二級結構。這反映出，重氮試劑與蛋白質間生物偶聯過程具有溫和性和高效性（圖4g）。
圖4. 試劑3與不同蛋白質中Cys的相互作用。a. 蛋白質中Cys與化合物3的反應圖示；b-e. 不同蛋白質與3的偶合產物的ESI-MS結果。（b）ubiquitin-3；（c）C2Am-3；（d）annexin-3；（e）albumin-3；f.C2Am-3經胰蛋白酶消化后得到的多肽片段YPYCELGGK的LC-MS/MS結果；g. albumin和albumin-3的CD結果。
緊接著，當重氮基團被引入目標生物分子后，可用高選擇的張力促進型環加成反應加以驗證（圖5）。
圖5. 蛋白質中重氮基團的鑒定。 a. 含重氮基團蛋白質與張力型炔烴8的環加成反應圖示；b-e. 不同重氮蛋白與8反應產物的ESI-MS結果圖。（b）ubiquitin-8；（c）C2Am-8；（d）annexin-8；（e）albumin-8。
為探究重氮試劑3在修飾半胱氨酸標記抗體中的潛在應用，作者選取2Rb17c進行實驗。2Rb17c是一種針對抗原HER2納米抗體，帶有一個半胱氨酸殘基。作者首先用還原劑TCEP處理2Rb17c抗體以得到游離的Cys；接著，在室溫下，將處理后的抗體與試劑3于pH8.0 NaPi緩沖液中反應，最終得到重氮納米抗體2Rb17c-3（圖6a、6b）。
圖6. 點擊反應助力重氮抗體的生成。a. 納米抗體2Rb17c與化合物3反應生成重氮納米抗體；b. 重氮納米抗體2Rb17c-3的ESI-MS結果；c. 重氮納米抗體2Rb17c-3與DBCO-Cy5 12發生1,3-偶極環加成反應；d. 熒光納米抗體2Rb17c-12的ESI-MS結果圖。
緊接著，作者利用細胞內點擊反應表征了重氮基團在生物成像中{attr}2234{/attr}（圖7）。實驗中，將高表達HER2受體的SKBR3細胞預先在有或無重氮納米抗體2Rb17c-3的溶液中孵育，再與DBCO-Cy5染料反應；洗脫多余的染料后，立刻對細胞進行共聚焦成像。經相同處理的低水平表達HER2的MCF-7細胞作為對照組。結果發現，預先用2Rb17c-3處理的SKBR3細胞熒光明顯，而單獨用染料處理或無HER2受體的細胞未檢測到熒光。以上表明，重氮基團修飾的納米抗體仍保留與HER2受體結合的能力，并且該基團可有效參與細胞內的點擊反應。
圖7. a. SKBR3細胞內，重氮納米抗體2Rb17c-3用于生物成像的過程圖示；b. SKBR3細胞先在有或無2Rb17c-3的溶液中孵育，再與DBCO-Cy5 12點擊染料共孵育后的共聚焦熒光成像結果。
最后，作者評估了重氮化合物作為探針標記細胞裂解液中半胱氨酸的可行性，并探索了最優的標記條件。最終實驗結果表明，重氮化合物可在HeLa細胞裂解液中與炔烴發生環加成反應。并且與銅催化反應相比，張力促進的環加成反應具有更好的蛋白標記效果（圖8）。
圖8. HeLa細胞裂解液中，3和13作為探針檢測半胱氨酸。a、b. 2.5mM 重氮酮3（a）或2.5mM 重氮酯13（b）分別于不同濃度（5~100mM）的DBCO-biotin和alkyne-biotin共孵育后的SDS-PAGE（上）和western blot（下）結果；c、d. 不同濃度（5mM、10mM、50mM）的重氮酮3（c）或重氮酯13（d）分別于100mMDBCO-biotin和100mMalkyne-biotin共孵育后的SDS-PAGE（上）和western blot（下）結果。
綜上，本文提出了一種在蛋白質和抗體特定位點快速且精確引入重氮基團的策略，這將有助于開發新的生物正交反應。
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https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.bioconjchem.0c00232
