羥基化作為一種廣泛存在的蛋白質翻譯后修飾，對蛋白質的結構穩(wěn)定性及功能調控至關重要。尤其是發(fā)生在脯氨酸上的羥基化，會顯著改變其化學性質，進而影響細胞信號傳導、代謝調控及疾病發(fā)生。然而，由于當前基于質譜的檢測方法難以區(qū)分羥基化和氧化修飾，同時受到其低豐度及外源氧化干擾的限制，脯氨酸羥基化的精準鑒定仍面臨巨大挑戰(zhàn)。 近日，南京大學蔣杰副研究員、龍億濤教授和上海師范大學鄒愛華教授合作，通過在納米孔道中引入疏水相互作用靈敏域，實現(xiàn)在復雜混合物中直接識別單個羥基化脯氨酸，并且不受周圍氨基酸氧化狀態(tài)的影響，為單分子水平的蛋白質羥基化檢測提供了全新的解決方案。
納米孔道技術作為一種高通量的單分子檢測手段，已在單分子DNA測序、疾病標志物檢測和蛋白質鑒定等領域取得重要進展。研究團隊基于多年來對納米孔道傳感機制的深入理解，將其拓展到對蛋白質上單個翻譯后修飾基團的識別，包括磷酸化、乙酰化、硫酸化等。這些翻譯后修飾通常體積較大，并伴隨氨基酸殘基電荷的變化。然而，目前納米孔道技術對于在脯氨酸上引入小體積、電中性的羥基化修飾的識別仍存在巨大困難。 研究團隊通過模擬天然羥基化脯氨酸結合蛋白的識別中心，創(chuàng)新性地在親水性納米孔道內腔中引入疏水相互作用增強域，利用羥基化修飾前后脯氨酸殘基的親疏水性反轉，基于孔道內的弱相互作用變化以特異性響應多肽上的單個脯氨酸羥基化修飾。以缺氧誘導因子（HIF）蛋白質羥基化為例，該方法在無需純化的條件下，實現(xiàn)了對不同HIF多肽片段上低豐度羥基化修飾的精準鑒定，即便在相鄰氨基酸存在氧化修飾的情況下，仍能實現(xiàn)高特異性檢測。 進一步，研究團隊基于羥基化修飾前后多肽進孔和穿孔行為的差異，發(fā)現(xiàn)了羥基化誘導的多肽在納米孔道進孔處、以及限域空間內的有效電荷變化。由于多肽的有效電荷與離子的屏蔽效應密切相關，這一現(xiàn)象揭示了羥基化通過增強親水性和極性，誘導多肽形成更為松弛的結構以促進蛋白質識別的潛在機制。 綜上，該工作不僅發(fā)展了一種新型測量方法，可直接鑒定蛋白質脯氨酸羥基化修飾，而且為針對蛋白質翻譯后鑒定的納米孔道界面設計提供了通用的設計策略，為未來探索更多未知的翻譯后修飾及其生物學功能和影響機制奠定了重要基礎。 論文信息 Precise Identification of Native Peptides with Posttranslational Proline Hydroxylation by Nanopore Jing-Wen Chang, Yan Gao, Prof. Ai-Hua Zou, Meng-Yin Li, Prof. Yi-Tao Long, Jie Jiang Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202422692
