on style="vertical-align: inherit; line-height: 1.75em; box-sizing: border-box;">▲第一作者：張寧寧
論文DOI：10.1021/acscatal.1c05579
該文章首次提出了將天然非催化蛋白質和催化功能聚合物結合形成一種新型人工酶，命名為人工多聚酶。該人工酶不但具有與天然酶相似的理化性質，而且具有穩定性高、催化位點可調控等優勢，以此可以有效地在催化水相中不對稱羥醛縮合反應。該研究開辟了人工酶制備的新途徑，擴展了基于脯氨酸的有機催化劑在不對稱催化領域的應用。酶催化在現代合成中發揮著重要作用。然而，天然酶的自身催化特性極大地限制了其實際應用。為此，人工酶的概念應運而生。通過將各種小分子非生物催化劑并入到蛋白載體中賦予其新的催化活性或者選擇性，例如，將有機金屬催化劑和小分子有機催化劑引入到蛋白支架中，形成了人工金屬酶和其他人工酶用于選擇性合成。此前的眾多研究充分證明了小分子催化劑和蛋白的結合在人工酶領域發展擁有巨大潛力。聚合物催化因其自身的眾多優點已經成為一個很吸引人的領域，尤其是嵌段共聚物可以進行模塊化設計，不僅能夠提供多樣的催化功能，還能通過大分子效應調節催化活性。鑒于此，聚合物催化劑已經被廣泛應用到合成轉化中，例如，聚合的L-脯氨酸用于催化羥醛縮合反應、分子印跡聚合物被用作為水解酶、聚合的過渡金屬復合物用于非對稱催化。這其中，脯氨酸催化的不對稱羥醛縮合反應是形成C-C鍵的重要工具。但與天然的I型醛縮酶相比，基于脯氨酸催化的該反應在水中存在轉化率低和選擇性差等缺陷。通常的解決方案是將脯氨酸進行疏水化修飾生成異質性/膠體催化劑，但這會造成非均相催化反應，無法真正模仿醛縮酶。而理想情況是均相且水溶性的人工醛縮酶可以在水相中催化該反應，但是其發展也充滿了挑戰。基于以上研究背景，我們首次將天然蛋白質作為生物支架，與脯氨酸聚合物結合形成水溶性的催化劑用于水相的非對稱羥醛縮合反應，實現了較高的催化活性的同時兼具優異的選擇性。綠色熒光蛋白（GFP）因其具有產量高，熒光性，易于進行系統表征等優勢而被選擇作為蛋白支架。在GFP接枝L-脯氨酸聚合物可分為兩步：（1）合成大分子引發劑，將小分子引發劑N-2-溴-2-甲基丙酰-β-丙氨酸N'-氧基琥珀酰亞胺酯通過酰胺偶聯反應隨機附著在GFP表面暴露的賴氨酸殘基上，得到蛋白引發劑并命名為GFP MI；（2）在4℃的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，通過原子轉移自由基聚合法（ATRP）將不同數量的脯氨酸單體聚合到GFP MI上，從而得到三種不同聚合度的人工酶，分別命名為ArPolyGFP-H、ArPolyGFP-M和ArPolyGFP-L。▲Scheme 1. “Grafting-from” atom transfer radical polymerization (ATRP) approach for fabricating “artificial polyenzymes” (ArPoly) as aldolase mimics for asymmetric aldol reactions.
▲Figure 1. (a) MALDI-TOF mass spectra of native GFP and GFP MI. (b) SDS-PAGE results (lane 1: native GFP; lane 2: GFP MI; lane 3: ArPolyGFP-L; lane 4: ArPolyGFP-M; lane 5: ArPolyGFP-H). (c) FTIR (d) CD and (e) UV-Vis spectra for native GFP, GFP MI, and ArPolyGFP. (f) General photograph of native GFP, all three ArPolyGFP dissolved in water (2.5 mg mL–1).
通過MALDI-TOF 表征顯示約20個引發劑分子成功連接到蛋白上；在SDS-PAGE結果中，天然GFP的離散帶消失，而在高分子區出現連續帶，從而確定了蛋白質聚合物偶聯物的成功構建；通過紅外光譜、圓二色譜、紫外-可見光光譜、熒光光譜確定了蛋白的二維和三維結構均沒有受到聚合影響，證明聚合接枝是一個非常溫和的反應過程。最終獲得的蛋白質-聚合物偶聯物具有如同天然GFP良好的水溶性，呈現出透明清澈綠色溶液（Figure 1f）。我們以環己酮和對硝基苯甲醛為底物，以水相中的不對稱羥醛縮合反應為模型反應對人工多聚酶的催化性能進行了探索。研究表明，相比于其它對照實驗組，ArPloyGFP對羥醛縮合反應具有更好的催化活性，ArPolyGFP-H、ArPolyGFP-M和ArPolyGFP-L的轉化率分別為82%、67%和56%。隨后，我們研究了pH值和溫度對人工酶催化性能的影響，結果顯示較低的pH能夠實現較高的對映體選擇性但同時也導致較低的轉化率。相反，提高溫度能大幅度提高轉化率（56%）且不會犧牲選擇性（91% ee）。這一結果表明了ArPolyGFP具有溫度依賴性，另一方面也表現出其熱穩定性的優勢。然而，當溫度進一步升高到55℃和65℃時，反應的選擇性消失，這可能是因為高溫使得蛋白質和聚合物之間的超分子相互作用減少，從而使反應不受控制。綜合考慮轉化率和選擇性，pH 3.0和35 ℃被視為該人工酶的最佳催化條件，在此條件下，相比于游離脯氨酸和空白對照（均未發生催化反應），天然GFP（9% ee），脯氨酸聚合物（13% 轉化率），ArPolyGFP實現了良好的轉化率和選擇性。隨著蛋白質上的脯氨酸聚合物的增多，轉化率從27%提高到33%，對映體選擇性從86%提高到94%。ArPolyGFP-H催化不對稱羥醛縮合效率最高，選擇性最好。通過對照實驗（天然GFP和脯氨酸聚合物的混合物）和反應機理分析，我們認為蛋白支架中的疏水環境可能是選擇性提高的關鍵因素。此外，ArPolyGFP在水溶液和凍干狀態下均表現出良好的穩定性。▲Table 1. Comparing catalysts for aqueous direct asymmetric aldol reactions of cyclohexanone with p-nitrobenzaldehyde under optimal conditions.
為了進一步證明該方法的通用性，我們選擇了穩定、無反應特性的商業蛋白—牛血清白蛋白（BSA）作為蛋白支架，在相同的條件下與脯氨酸聚合物結合，得到了ArPolyBSA-L、ArPolyBSA-M和ArPolyBSA-H并對其進行了表征。▲Figure 2. (a) MALDI-TOF mass spectra of native BSA and BSA MI. (b) SDS-PAGE results (lane 1: native BSA; lane 2: BSA MI; lane 3: ArPolyBSA-L; lane 4: ArPolyBSA-M; lane 5: ArPolyBSA-H). (c) Dynamic light scattering (DLS) results of native BSA and ArPolyBSA-H. (d) CD and (e) UV-Vis spectra for native BSA and ArPolyBSA. (f) General photographs of native BSA and all three ArPolyBSA dissolved in water (2.5 mg mL–1).
在最佳反應條件下，我們通過上述不對稱羥醛縮合反應測試了ArPolyBSA的催化性能。結果表明ArPolyBSA能夠實驗較好的轉化率和選擇性。我們分析推測GFP和BSA催化性能的差異可能是由于其組成和結構的不同造成的?？傊?，結果表明各種蛋白質都可以用作人工酶的生物支架，這種方法用途廣泛。我們進而分析了ArPolyBSA的底物范圍，發現該人工酶可以催化帶有不同吸電和斥電基團的丙烯醛，并在大多數反應中實現了很好的選擇性和較好的轉化率。▲Table 2. ArPolyBSA-H catalyzed aqueous direct asymmetric aldol reaction of cyclohexanone with various arylaldehydes.
我們提出了一種通過結合脯氨酸聚合物和蛋白質來創造人工酶的聚合物方法。通過該方法獲得的人工多聚酶（ArPoly）不僅具備良好的水溶性，而且能在水中有效地催化羥醛縮合反應，實現了優異的對映選擇性。這一發現具有重要意義，它證明了大分子有機催化劑具有能被設計定制成為人工酶的巨大潛力。此外，利用兩種不同的蛋白質作為生物支架，我們證明了該方法在人工酶領域的穩健性和通用性。另一方面，更多的其他生物支架，從非活性蛋白到活性酶，都可以應用于該方法中產生多種多樣的定制人工酶。南丹麥大學化學系的吳昌柱教授課題組專注于生物催化領域的研究，包括生物界面催化，人工酶，酶的固定化等用于級聯反應及新型有機反應。https://www.wugroup.sdu.dk/https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c05579
